生物分离工程5细胞破碎技术).pptVIP

第四章 细胞破碎 技术 一、概 述 二、常用的细胞破碎技术及其应用 三、细胞破碎技术研究的发展方向 四、思考题 一、概 述 （一）细胞破碎的意义 （二）细胞壁的成分与结构 （三）细胞破碎过程的检测 （一）细胞破碎的意义 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性药物成分都是必要的。 细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系 上游通过细胞的生理状态对细胞破碎效果产生影响；而下游则要考虑去除细胞碎片和细胞蛋白质的污染等对产品活性的影响。 细胞破碎过程中必须考虑的因素 细胞壁的坚韧程度 、目标产品的性质 、破碎的规模、方法 、费用等 . （二）细胞壁的成分与结构 细菌细胞壁 主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多层网状结构。 霉菌的细胞壁 大多由几丁质和葡聚糖构成，还含有少量蛋白质和脂类。 酵母和真菌的细胞壁 主要为葡聚糖为β-1，6葡聚糖，通过β-1，3糖苷键与D-葡萄糖第一侧链交联，也含有甘露糖和几丁质 植物细胞壁 含纤维素、半纤维素、木质素等 原核细胞的结构 酵母细胞的结构 植物细胞的结构 （三）细胞破碎过程的检测 ①革兰氏染色法 ②次甲基蓝染色法 ③测定核酸与蛋白质含量 ④离心细胞破碎液观察 ①革兰氏染色法 用革兰氏染色剂进行染色破壁的酵母呈粉红色，而未破壁的酵母呈兰紫色，分别计数，并采用相同的稀释度用血球记数板进行镜检记数，计算破壁率。 ②次甲基蓝染色法 取未经灭活的发酵液 0.5ｍＬ ,用 9ｇ/Ｌ的生理盐水稀释 1 0 0倍后 ,用次甲基蓝染色5ｍｉｎ ,用血球计数板计数 ,计算出细胞的存活率。 酵母存活率 ： =[1 -(染色细胞总数 /酵母细胞总数 ) ]×100 %. ③测定核酸与蛋白质含量 分别在 2 60和 2 80ｎｍ波长下 ,测定发酵液的光吸收值，用Lorry法测量细胞破碎后上清中的蛋白质含量也可以评估细胞的破碎程度，判断细胞破碎率。 核酸提高率： =[(处理后发酵液的吸光值 /未处理发酵液的吸光值 ) -1]×100% ④用离心细胞破碎液观察 用离心细胞破碎液观察沉淀模型的方法来确定细胞破碎率，完整的细胞要比细胞碎片先沉淀下来，并显示不同的颜色和纹理。对比两项，可以算出细胞破碎率。 二、常用的细胞破碎技术及其应用 (八)化学渗透法 化学渗透法是使用某些有机溶剂(如苯、甲苯)、螯合剂(EDTA)、表面活性剂(SDS、triton X-100)、变性剂 (盐酸胍、脲)等改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。 化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成，不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。 化学渗透法有利也有弊 EDTA EDTA作为螯合剂，可用于处理革兰氏阴性菌(如E．coli)，对细胞的外层膜有破坏作用。革兰氏阴性菌的外层膜结构通常是靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持的，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，使外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，导致该区域通透性增强。 Triton X-100 Triton X-100是非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是内膜的双磷脂层。tritonX—100常与其它试剂混合使用。 盐酸胍和脲 盐酸胍和脲是常用的变性剂。一般认为胍能与水中氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白。 盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白(如包含体)，并在其它试剂的配合下使其二硫键断裂，变性解离成单体，从而释放出来。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链内或肽链间的二硫键，再折迭复性成具有活性的蛋白质立体结构。 化学渗透法的优缺点 优点： ①对产物释出具有一定的选择性。 例如用0.2mol／L胍处理E.coli C600-1，5h后80％位于胞间质的β-内酰胺酶释放出来，而总的蛋白释放率仅为4％。 ②细胞外形完整；碎片少，有利于后分离。 ③核酸释出量少，浆液黏度低，便于进一步提取。 缺点： ①时间长，效率低。②化学试剂具有毒性。 ③通用性差。 （一）高压匀浆破碎法 1、高压匀浆阀及其破碎机理 2、温控与能耗 3、 存在的问题 1、高压匀浆阀及其破碎机理 实验室级高压均质仪 高压细胞破碎机 2、温控与能耗 将温度控制在35℃以下，那么酶活损失可以忽略