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第 PAGE 3页 高效液相色谱法测定人肌腱中的胶原蛋白 邹晓莉1 黎源倩*1 曾红燕1 周健1 秦廷武2 莫湘涛2 （四川大学华西公共卫生学院卫生检测教研室1，成都 610041） （四川大学华西医院干细胞与组织工程实验室2，成都 610041） 摘要 目的：建立测定人肌腱中胶原蛋白含量的高效液相色谱法。方法：动物肌腱中的胶原蛋白经酸水解后生成羟脯氨酸，通过2，4-二硝基氯苯衍生后，0.01mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液(pH 6.0):乙腈（80：20）洗脱，经反相C18柱分离，紫外检测器于360nm波长处测定羟脯氨酸，根据样品中羟脯氨酸的含量计算胶原蛋白的含量。结果：优化了酸水解、衍生化反应和高效液相色谱测定条件。本方法的检出限为0.003?g/ml，羟脯氨酸在0.003?g/ml ~100?g/ml范围内线性良好，样品测定的相对标准偏差为1.95%，加标回收率98.4% 关键词：胶原蛋白；羟脯氨酸；肌腱；高效液相色谱法 中图分类号: Determination of collagen in tendon by reversed-phase high performance liquid chromatography Zou Xiaoli Li yuanqian* Zeng hongyan Zhou jian Qing tingwu Mo xiangtao (Department of Sanitary Technology, West Sichuan University, Chengdu, 610041) Abstract Objective: A method for determination of collagen in tendon by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was developed. Method: After having been hydrolyzed by hydrochloric acid, and derived with 2，4-Dinitrochlorobenzene, the samples can be determined by HPLC (reversed-phase C18 column, pH6.0 0.01mol/LNaAC-HAC:CH3CN（80：20）, wavelength was 360nm). Results: The factors of hydrolysis, derivation were studied. 60 samples were analyzed with the proposed method. The linear was good ranged from 0.003?g/ml to 100?g/ml and the detection limit was 0.003?g/ml. The RSD of determination was 1.95%. The recoveries were 98.4~110.8%. Conclusion: The method was sensitive, accurate Keywords: Collagen hydroxyproline tendon HPLC 胶原蛋白是人和动物的主要结构蛋白，约占人体内蛋白质总量的三分之一，它在体内的合成及分解变化涉及多种疾病，并与其它细胞外间质成分一起在肿瘤的发生与转移过程中发挥了重要作用[1]。目前，在肌腱的损伤修复中，常利用植入异体肌腱材料来刺激成纤维细胞的增生，从而增加胶原蛋白的合成并提高胶原纤维的生成[2]。在新腱生成的同时，植入的异体肌腱会不断地降解、吸收直至完全消失，但若植入的异体肌腱在体内长期不能腱化和降解，则会大大影响治疗的疗效和愈后。为了探讨肌腱的损伤修 作者简介：邹晓莉（1971-），女，博士，副教授。 HYPERLINK mailto:Zouxl_1113@163.com Zouxl_1113@163.com,*通讯联系人：黎源倩，女，教授 复，将人体肌腱植入动物（兔子）体内，并在不同时段取出植入的人体肌腱，通过检测取出的人体肌腱中胶原蛋白含量的变化来反映其降解情况。传统检测胶原蛋白的方法主要有比色法和凝胶电泳法[3~4]，其操作烦琐，影响因素多，测定精密度较差，不能满足该研究的要求。而羟脯氨酸作为胶原蛋白的特异性氨基酸，在其中含量较为稳定，因而可通过测定羟脯氨酸的含量来计算胶原蛋白的含量。测定氨基酸的方法主要是采用氨基酸分析仪[5]，但氨