m6A 甲基化研究方法.docxVIP

RNA甲基化修饰（m6A）研究思路及方案设计 RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。目前发现microRNA，circRNA, rRNA, tRNA 和snoRNA上都有发生m6A修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_1 \o Fu, 2014 #8522 1]。“编码器(Writer)”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消码器）可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白（读码器）有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。 m6A酶系统 METTL3是早先被鉴定为结合SAM的组件，其缺失引起小鼠胚胎干细胞、Hela细胞和HepG2 细胞中m6A peaks的减少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的细胞核内亚细胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，显示ｍ６Ａ修饰可能和ＲＮＡ的剪切加工相关。WTAP与METTL3–METTL14 二聚体相互作用，并共定位于核小斑，影响甲基化效率，参与mRNA剪。而KIAA1429作为候选的甲基转移酶复合体的新亚基，是整体甲基化进程所必须的 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_2 \o Schwartz, 2014 #8496 2]。FTO是ALKB家族的成员，作为第一个被发现的去甲基酶，可影响剪切因子SRSF2的RNA结合能力，进而调控pre-mRNA的剪切加工过程 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_3 \o Zhao, 2014 #8497 3]。目前已发现FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相关， 揭示m6A可能对这些疾病具有重要的调节功能 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_4 \o Fu, 2013 #8498 4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被发现具有去甲基作用的另一个成员，以RNase A敏感的方式与核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_7 \o Zheng, 2013 #8501 7]. 此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影响新生mRNA合的成和剪切效率 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_7 \o Zheng, 2013 #8501 7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表现出精子发生异常，这可能是精子发生相关基因表达改变的结果 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [ HYPERLINK \l _ENREF_7 \o Zheng, 2013 #8501 7]。m6A mRNA修饰执行其功能主要通过两个途径： 精细调控甲基化转录本的结构，以阻止或诱使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 结合蛋白识别，诱发后续反应。目前一类含有YTH功能结构域的蛋白被鉴定为m6A修饰的结合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2己被证实是ｍ６Ａ的结合蛋白. YTHDF1主要影响ｍ６Ａ修饰基因的翻译，YTHDF2主要影响ｍ６Ａ修饰基因的降解，而YTHDC1结合ｍ６Ａ修饰的基因后影响其剪接。HNRNPC是一种丰富的核RNA结合蛋白，参与pre-mRNA的加工 ADDIN EN.CITE EndNoteCiteAuthorCienikova/AuthorYear2014/YearRecNum8503/RecNumDisplayText[8]/DisplayTextrecordrec-number8503/rec-numberforeign-keyskey app=EN db-id=f2s2fdzw5a5wp6epsfu5dtfpwwfa