第二章蛋白质的结构与功能讲述.ppt

（二）多种方法可使蛋白质沉淀 沉淀蛋白质的方法 盐析 有机溶剂沉淀 有机酸沉淀 重金属盐沉淀 分散在溶液中的蛋白质分子发生凝聚，并从溶液中沉淀、析出的现象称为蛋白质的沉淀。 1、盐析法 盐 析 用高浓度的中性盐沉淀水溶液中 蛋白质的方法。 常用盐 硫酸铵、（亚）硫酸钠、氯化钠等。 盐析原理 破坏水化膜，中和电荷 分段盐析 逐步增加中性盐浓度使蛋白质 从溶液中分段析出加以分离。 如：PH=7.0时 半饱和硫酸铵可沉淀血清球蛋白， 饱和硫酸铵可以沉淀血清白蛋白。  2、有机溶剂沉淀蛋白质 机制 乙醇、甲醇、丙酮等能破坏 蛋白质的水化膜，在等电点可 使之沉淀。 关键 快速低温操作防止变性。 COO- COOH COOH P H+ P CCl3COO- P NH3+ NH3+ NH3+-OOCCl3C 3、有机酸沉淀蛋白质 苦味酸、钨酸、鞣酸及三氯醋酸等酸性物质可与蛋白质正离子结合成不溶性的蛋白盐沉淀。条件：pHpI 如用三氯醋酸制备无蛋白血滤液 条件：pH pI NH3+ NH2 NH2 P OH- P Ag P COO- COO- COOAg 　　　　　 4、重金属盐沉淀蛋白质 重金属离子如汞、铅、铜、银等可与 蛋白质负离子结合形成蛋白盐沉淀。 应用： 重金属盐中毒，口服大量乳品、蛋清并催吐。 超速离心法 不同蛋白质大小、形状不同，在一定的离心力场作用下沉降速率不同，可用于分离蛋白质和测定其分子量。 （三）透析、超滤与超离心技术可用于 分离蛋白质 超滤 是利用超滤膜在一定压力下使大分子蛋白质滞留，而小分子物质和溶剂滤过。 透析 将混杂有低分子物质的蛋白质溶液放于半透膜透析袋内，除去低分子杂质，以达到纯化蛋白质的目的。 三、蛋白质的紫外吸收和呈色反应 含共轭双键的aa（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）最大吸收峰：280nm （一）蛋白质的紫外吸收特征可用于定量分析 蛋白质溶液的最大吸收峰：280nm 在碱性条件下，蛋白质分子内的肽键可与Cu2+作用生成紫红色络合盐。 应用： - 蛋白质、多肽的定量测定 - 检测蛋白质的水解程度（aa无此反应） 肽键及特殊基团可与有关试剂发生呈色反应。 1、双缩脲反应 （二）蛋白质的呈色反应可用于 定性、定量分析 2、茚三酮反应 在pH5～7的溶液中，蛋白质游离?-氨基与茚三酮反应生成蓝紫色化合物。 应用：蛋白质的定性、定量测定。 3、酚试剂反应  在碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸可与酚试剂（磷钨酸与磷钼酸）反应生成蓝色化合物。 应用：蛋白质的定性、定量测定。 　　 灵敏度比双缩脲反应高100倍。 四、蛋白质具有变性性质 变性的概念 　　蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构（次级键，特别是氢键）受到破坏，生物学活性丧失，理化性质发生改变，这种现象称为蛋白质的变性（denaturation） 。 （一）多种理化因素可以引起蛋白质变性 物理因素： 高温、高压、振荡或搅拌、射线线、超声波 化学因素： 强酸、强碱、尿素、有机溶剂和重金属离子等 使蛋白质变性的因素 * 次级键破坏→空间结构的破坏或改变 * 肽键没有断裂→不涉及一级结构的改变 （二）蛋白质变性的实质是原有的特定空间 构象被破坏或改变 蛋白质变性的实质 少数蛋白质变性后，除去变性因素，仍可恢复或部分恢复原有的构象及功能，称为复性（renaturation）。 1、生物学活性丧失 　 如激素的调节作用，酶的催化作用 2、疏水基团暴露，溶解性显著降低 易沉淀，若在远离pI的pH环境，可不沉淀 因此：变性的蛋白不一定沉淀 沉淀的蛋白不一定变性 3、分子的不对称性加大