降钙素基因在乳酸菌中的表达及其对蛋鸡骨质疏松症防治作用的分析-预防兽医学专业论文.docxVIP

中文摘要我们研究小组成功构建了以ThyA基因为选择压力的乳酸杆菌非抗生素 中文摘要 我们研究小组成功构建了以ThyA基因为选择压力的乳酸杆菌非抗生素 抗性表达载体pW425t，并成功的表达了鸡球虫S07基因，为了进一步验证 该载体表达小分子蛋白质药物的功能，特地进行了本项研究。 首先对某大型蛋鸡场产蛋高峰期及高峰后期(27周龄、39周龄、51周 龄)的海兰褐色蛋鸡和瘫痪蛋鸡体内的降钙素(CT)水平进行了检测。并对 ， 瘫痪蛋鸡进行了病理剖检和X光检测。f结果发现，产蛋高峰期时，笼养蛋鸡 体内CT水平先上升，然后逐渐下降，瘫痪蛋鸡体内CT水平最低。从x光 照片中可以看出，瘫痪鸡的趾骨明显弯曲。与正常鸡比较，瘫痪鸡的胫骨和 跖骨略弯，且骨密质变薄。髓质不均匀。髓腔变宽，髓质减少。说明降钙素 在蛋鸡骨质疏松症的发生过程中起到了内在的作用。户／ ／ 根据鲑鱼降钙素基因的序列，合成了鲑鱼降钙素(sCT)基因。连接到 pBlueseriplI质粒载体中，命名为pCAGl64，并转化到JMl09大肠杆菌中。 ／ ／大量提取质粒pCAGl64，用Sacl和Kpnl双酶切法切下目的基因，通过低溶 L 点胶回收纯化目的片段，用相同方法将pW425t质粒载体切开，通过低溶点 胶回收纯化载体。用T·DNA连接酶将CT基因连接到以ThyA基因为选择 压力的非抗生素抗性表达载体pW425t中，转化ThyA基因缺陷的大肠杆菌 托』。用PCR法和Sacl／Kpnl双酶切法筛选得到了阳性重组质粒pWCT，在载 体上游设计了一条引物，用该引物对pWCT进行序列测定。结果表明，目的 基因所编码的氨基酸序列与天然鲑鱼降钙素的氨基酸序列完全一致。大量提 取重组质粒pWCT，纯化后，采用电穿孔法转化ThyA基因缺陷型乳酸杆菌 LaSl07。通过少量提取质粒法，筛选得到了阳性重组乳酸杆菌三口s3l 8。应 用放射免疫分析法，证明重组大肠杆菌和重组乳酸杆菌的培养上清中均含有 降钙素，其中的重组降钙素(rCT)含量分别达到779ng／L和905ng／L，说 明rCT可以分泌到大肠杆菌和乳酸杆菌的细胞外。／j{j 明rCT可以分泌到大肠杆菌和乳酸杆菌的细胞外。／ j{j SD系大白鼠对乳酸杆菌LaS31 8表达的基因工程重组降钙素(rCT) 的生物学效应进行了研究力l第一次预实验结果显示，LaS31 8培养上清可使 、 大自鼠血钙由1 0．6mg／l 00ml下降到9．4mg／100ml，证明LaS31 8培养上清中 的重组降钙素具有降低大白鼠血钙的作用，第二次预实验结果显示，LaS31 8 培养上清中重组降钙素的生物学效价接近4mu／ml。然后，利用降钙素国际 标准品，通过平行线原理四点法(2．2法)测定了LaS3l 8培养上清中重组降 钙素的生物学效价为2．72mU／mL，其95％可信效价范围为2．1 8～3．24mU／mL， 平均可信限率为19．42％，说明实验结果比较精确，误差较小。，／ ／ 用表达降钙素基因的LaS31 8对2群笼养蛋鸡进行动物试验，以瘫痪鸡数 量，产蛋率，血清降钙素含量为检查指标。试验结果表明，使用LaS3l 8的 试验组，鸡群中瘫痪鸡的数量比对照组减少：出现瘫痪的骨质疏松症患鸡服 用LaS31 8一个月后。25％的鸡可恢复站立。证明重组乳酸杆菌LaS31 8对笼 养蛋鸡骨质疏松症具有较好的防治效果。 厂 ／通过本项研究，证明了乳酸杆菌非抗生素抗性表达载体pW425t是有效 L 的，可以用该载体表达各种微生物、寄生虫的功能基因，也可以用来表达各 j／ 种小分子蛋白旗药物W 关键词：降钙素，乳酸杆菌，、像达，笼养蛋鸡，骨质疏松症 一矿 ／扑， Studies Studies on Expression of Calcitonin Gene in Lactobacillus and Its Capability to Prevent and Treat Caged Layer Osteoporosis ABSTRACT Four groups of Hyline-brown caged layer(1 0 chicken each group)were examined on serum CT by RadioimmunOa5say system， Shankbone and metatarsus were selected for X-ray examination．Results indicated that serum CT increased first，then decreased slowly，serum CT changed greatly in laying fastigium．Shankbo