多克隆抗体的制备方法与原理.pdfVIP

麦约尔生物技术有限公司 Tel: 021 抗体的制备方法与原理抗体的制备方法与原理 抗体的制备方法与原理抗体的制备方法与原理 一、一、抗血清的制备抗血清的制备 一一、、抗血清的制备抗血清的制备 有了质量好的抗原 ，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好 （特异性强和效价高）的抗体。 （（一一））用于免疫的动物用于免疫的动物 （（一一））用于免疫的动物用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类 ，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、 山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗 r-免疫 球蛋白抗血清 ，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适 ///雄性 ，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在 龄，健壮 ，无感染性疾患，最好为 免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以 2～3kg 为宜。 （（二二））免疫途径免疫途径 （（二二））免疫途径免疫途径 免疫途径有多种多样 ，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等 ，一般常用皮下或 背部多点皮内注射 ，每点注射 0.1ml 左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、 毒素等生物学活性抗原 ，一般不宜采用静脉注射。 （（三三））佐剂佐剂 （（三三））佐剂佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同 ，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在 注射抗原的同时 ，加入能增强抗原的抗原性物质 ，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐 剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间 ，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统， 使参与免疫反应的免疫活性细胞增多 ，促进T 细胞与 B 细胞的相互作用 ，从而增强机体对抗原的细胞免疫 和抗体的产生。 常用的佐剂是福氏佐剂 （Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂 1 份、石腊油 5 份，羊毛脂与石腊 油的比例 ，视需要可调整为 1 ：2～9 （V/V），这是不完全福氏佐剂 ，在每毫升不完全佐剂加入 1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法 ：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内 ，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4 ℃下保存备用 。 免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状 ，也可以在免疫前取需要量佐 剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液 （其中加卡介苗 3～4mg/ml 或不加），加完后再继 续研磨成乳剂 ，滴于冰水上5～10min 内完全不扩散为止。为避免损失抗原 ，亦可用一注射器装抗原液， 第 1 页 共 14 页 麦约尔生物技术有限公司 Tel: 021 另一注射器装佐剂 ，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检 查合格后即以其中一注射器作注射用。 （（四四））免疫方法免疫方法 （（四四））免疫方法免疫方法 抗原剂量 ，首次剂量为 300～500µg ，加强免疫的剂量约为首次剂量为 1/4 左右。每 2～3 周加强免疫 一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗 0.5ml ，加强免疫时不必注射百日咳疫 苗。 在第2 次加强免疫后2 周，从耳缘静脉取2～3ml 血，制备血清 ，检测抗体效价 （见后）。如未达到 预期效价 ，需再进行加强免疫 ，直到满意时为止 （图2-3）。当抗体效价达到预期水平时 ，即可放血制备 抗血清。