凝胶层析原理...ppt

五、凝胶的结构与性能 1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构 （2）特点： 交联度： 交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松 化学性质： 稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强酸 （2）特点： Sephadex的分级范围 G10 700 G15 1,500 G25 1,000-5,000 G-50 1,500-30,000 G-75 3,000-70,000 G100 4,000-150,000 G150 5,000-400,000 G200 5,000-800,000 吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸水量（ml）x10 如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml 大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。 2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose) 3.聚丙烯酰胺凝胶 ■ 各 种 层 析 胶 体 ： Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glucose agarose glucose + acrylamide cellulose Bio-Rad BioGel P BioGel A acrylamide agarose 六.其它条件选择 1.柱的选择 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象 2.样品的选择： 量适当, 粘度小 3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用 七、应用 1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量 Elution volume (ml) Albumin NaCl Desalting in a simple column 测分子量 Ve log Mr 对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(MW)大小顺序流出,MW大的走在前面,Ve与MW的关系可用下式表示: Ve = K1 - K2lgMW K1,K2 为常数, MW为分子量 实验： 凝胶层析法分离蛋白质 血红蛋白 64,480 二硝基苯-鱼精蛋白 2,000-12,000 Sephadex G-50 孔径 1,500-30,000 一、原理： Kd=0 Kd=1 1、装柱 ※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积 ※凝胶不能有气泡和分层现象 ※装柱结束后要保持凝胶表面平整 二、操作注意点： ■ 凝胶柱的装填方法： 装 填 胶 体 暂 停 流 洗 X 继 续 流 洗 已 堆 积 沉 淀 中 上 清 紧 密 堆 积 检 查 好 管 柱 是 否 畅 通 1 2 Gel Gel 继 续 流 洗 2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口 ※加样时尽量不要破坏凝胶面 ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱 血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积？ 三、结果要求： * 小 结 染色液 加样方式 SDSIEF PAGE 琼脂糖凝胶电泳 醋酸纤维素电泳 分辨率 电泳形式 支持介质 电极缓冲液 原理 名称 层 析CHROMATOGRAPHY 一、概述 1、定义 层析(又名色谱) 一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。 分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力分子亲和力吸附能力 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析 2、物理化学性质间的差异 吸附层析 L L ■ 层析分析法的基本原理： 流动相 Mobile phase 固定相 Stationary phase 样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一 吸附层析 分配层析 Liquid - Solid Liquid - Liquid 两相系统 A B C 每次分离样本 都要做一次选择 One Plate of Separation (理论板数) S 极 性 L 非 极 性 极 性 非 极 性 样本 样本 1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带; 3、层析的发展 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 194