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重组基因导入受体细胞 生物与食品工程学院 重组基因导入植物受体细胞 土壤农杆菌介导的Ti质粒转化 土壤农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色曾阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无感染能力。 外植体 用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体 土壤农杆菌Ti质粒转化基本程序 外植体的选择 组织 年龄 再生能力 接种 浸泡，时间：几秒到几分钟，不超过30分钟 共培养 外植体与农杆菌共培养，时间：几天 脱菌培养 用抗生素除去多余的农杆菌 继续培养 筛选 叶盘法转化植物细胞 用打孔器获取圆型小片（叶盘） 在农杆菌菌液中浸泡 长芽培养 生根培养 整体植株接种转化 人为在植株上造成创伤 在植株表面接种农杆菌 获得转化的植物愈伤组织或转基因植株 叶盘转化与整体植株转化的特点： 优点：操作简单、实用性广 缺点：会产生嵌合体 原生质体共培养转化法 从幼苗嫩叶制备原生质体 - 悬浮液 在培养皿中培养 原生质体刚形成细胞壁时，添加农杆菌 培养32h后，洗去游离的农杆菌 继续培养，筛选 优点：转化植株来源于同一个细胞，减少了嵌合体的发生 缺点：原生质体再生困难，成功率低 悬浮细胞共培养转化法 建立悬浮细胞系 悬浮细胞与农杆菌液混合 转移到固体培养基 筛选 培养成苗 类似于原生质体共培养 植物病毒介导基因转移 植物病毒通过感染植物细胞将特定的基因整合到染色体上并进行稳定的遗传和表达。 花椰菜花叶病病毒 CaMV 烟草花叶病毒 TMV 化学诱导DNA直接转化 多聚物介导 原理：一些多聚物和二价阳离子与DNA混合，能在原生质体表面形成颗粒，通过原生质体的内吞作用而被吸收进细胞内。 聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸 优点：操作简单、对细胞伤害小、实用范围广 缺点：建立原生质体再生系统比较困难 化学诱导DNA直接转化 脂质体介导基因转化 原理：利用人工构建的磷脂双分子层组成膜物质包裹DNA分子形成球型体，利用细胞原生质体的内吞作用或融合作用将重组DNA分子转运到细胞内。 优点：1. 转化率较高 花粉管通道 将外源重组DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化早期的胚胎细胞，获得植物种子。 重组DNA制备 分析植物受精过程、掌握重组基因导入最佳时间 用重组基因处理柱头的方法：柱头涂抹、柱头切除、花粉粒吸入 后代材料分析与处理 优点：技术简单、易于掌握能避免体细胞变异 物理法介导DNA直接转化 基因枪转化 原理：利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基因转化方法。 将外源DNA溶液与钨或金的颗粒混匀保温，DNA分子便可吸附在金属颗粒表面。 钨粉会产生对细胞有害的氧化物 金粉性质稳定，球型规则，但价格昂贵 转化率一般在10-4 - 10-2频率范围 物理法介导DNA直接转化 超声波介导转化 原理：利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆型地击穿细胞膜并形成膜通道，使外源DNA进入细胞。 该方法可以避免脉冲高电压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活，但该转化方法尚待进行更深入的研究。 物理法介导DNA直接转化 激光微束穿孔转化 原理：激光微束直径小，能量高，能引起细胞膜可逆性穿孔，出于细胞周围的DNA分子随之进入细胞。 优点：转移效率高，无宿主限制，可对细胞器操作 缺点：需要昂贵的设备，技术条件要求高，稳定性和安全性不如电击穿孔。 物理法介导DNA直接转化 显微注射 原理：利用显微注射仪，通过机械方法将外源DNA分子直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 显微注射的关键是细胞固定，动物细胞具有独特的贴壁生长的特点，因此不存在固定的问题；植物细胞则需要通过包埋、多聚赖氨酸粘连，吸管支持等方法固定。 物理法介导DNA直接转化 显微注射 优点：转化效率高达10～20％ 缺点：需要专门的仪器和精细的操作技术 重组基因导入动物受体细胞 相对于原核细胞，动物细胞很难捕获外源DNA。 外源基因导入动物受体细胞的主要方法有：电激穿孔，基因枪，显微注射等。 适用于动物细胞的有：磷酸钙转染，二乙胺乙基葡萄糖转染等。 重组基因导入动物受体细胞 磷酸钙转染 哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 步骤： 1. 将外源DNA与氯化钙制成CaCl2-DNA溶液 2. 加入到Hepers-磷酸钙溶液，形成DNA-磷酸钙共沉淀物。 3. 用吸管将沉淀物转移到动物细胞表面 4. 培养 Thank You * *