细胞原生质体的分离与融合.pptx

实验九 植物原生质体分离及融合;二、实验原理 ? 植物原生质体是具有质膜，但去掉了细胞壁的植物细胞，分离的原生质体在培养条件下具有再生新壁，进行连续的细胞分裂．并分化成完整植株的能力，即具有细胞全能性。细胞壁的主要成份是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶，果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁。由于质膜完全暴露，原生质体具有摄取大分子(如核酸)，细胞器(如核、叶绿体)和细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料。而原生质体融合是实现上述目的的一个极为重要的手段。同种或异种原生质体可在聚乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生物类型。;PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合;三、实验用品 (一)材料：植物叶片(菠菜叶片) (二)用具：倒置显微镜，离心机，过滤筛(100目)，漏斗，烧杯，吸管，长注针，注射器(5-10m1)等； (三)试剂： 1．纤维素酶2％，果胶酶l％。 在0.65M甘露醇，0.05MCaCl2·2H20和0.1％MES中，PH调至5.6-6.0。 2．0.16M CaCl2·2H20溶液(内含0.1％MES)PH5.6。 3．22％蔗糖溶液。 4．30％聚乙二醇(PEG)溶液 5．高PH高钙洗脱液(PH=9) 0.1M CaCl2·2H20 0.1M梨酶醇 0.5ml／100ml 1M Tris 6．0.24M CaCl2·2H20;四、实验方法 (一)原生质体的分离收集： 1．取菠菜叶片撕去下表皮，每小组称0.2g．切成小块放到10ml酶液中，在26℃下酶解4-5小时，或酶含量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。 3．用与滤液等体积的0.16M CaCl2·2H20溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4．滤液用离心机100-300rpm，离心5分钟弃上清。 5．沉淀中加入0.16M CaCl2·2H20溶液1-2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离心管底部轻轻地加入6-8ml 22％蔗糖溶液，使之形成界面。 6．静置待原生质体形成??条带时弃去上、下液及残渣，用吸管吸取收集原生质体。 ;蔗糖漂浮方法： ?? 1）用细口吸管吸22%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面). ?? 2静置后此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， ?? 3) 用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中;7．用0.24M CaCl2·2H20溶液洗涤一次，离心吸去上清液。 8．沉淀中加入l-2mlO.16MCaCl2·2H20溶液悬浮沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密度为2×105个／ml。 9．取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。 ; (二)原生质体融合操作 1．取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置l0分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。 2．在两滴悬液之间加1滴30％PEG液，使3滴溶液相连，室温下(15℃-20℃)作用5-l0分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。