影响载体构建的关键因素.docVIP

PAGE PAGE 2 影响载体构建的关键因素 白利利1,2 杨慧兰*1 樊建勇1 （1.广州军区广州总医院皮肤科 广东 广州 510010 2.华南理工大学生物科学与工程学院 广东 广州 510006） 摘 　 要 : 目的 为载体构建提供方法参考。方法 总结载体构建实验中各个环节的经验教训。结果 确立了分子克隆中的关键影响因素。结论 实验中小细节是影响实验的关键。 关键词 :载体构建; 注意事项；问题与分析中图法分类号 : Q78; R331　　　 文献标识码 : A Key factors in the construction of plasmid BAI Li-li1,2,YANG Hui-lan*1 ,FAN Jian-yong1 (1.Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Dermatology guangdong guangzhou 510010 2.South China University of Technology, Biological Science and Engineering School guangdong guangzhou 510006 基金资助：全军医学科学技术研究“十一五”计划课题项目.课题编号06J008. 作者简介：白利利，女，山东泰安人，在读硕士研究生，从事病毒分子生物学研究。电话：(020Email:bll-1012@163.com 通信作者：*杨慧兰 ，电话: 02036653508. Email:huilany@ Abstract: Objective To supply method reference for construction of plasmid . Methods Summary the experience in the component of construction .Results Establish the key factors in the plasmid construction .Conclusion Tiny details in the experient are the importantelements to construction of the plasmid . Key words:plasmid construction ;announcements; problem and analyze 载体构建是分子生物学常规实验。其过程无非包括：“扩，切，连，转，筛”五个步骤，虽然简单，但影响因素很多，任一步操作不当都会影响构建结果，现将构建过程中的注意事项分析如下： 目的片段的PCR扩增 1.1 引物的设计 A:引物的长度一般为15 bp～30 bp,常用的是18 bp～27 bp，但不应大于38 bp. B:引物3’端避免出现3 个以上的连续碱基,同时避免在引物的3 C: 引物序列的GC 含量一般为40%～60%，上下游引物的GC含量不能相差太大 D: 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。 E: 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点, 进行分析，选择目的基因不含的酶切位点，另外在酶切位点的5’端添加2个～ F: 公司合成后的引物序列单一定要检查，有时会出现合成错误的情况。 1.2 PCR反应条件的优化[1] A:优化PCR反应的基本条件以增加特异性 B:加入优化增强剂，如DMSO,PEG-600,甘油，非离子去污剂，甲酰胺，牛血清白蛋白等 C:采用热启动技术 1.3 常见问题及分析 A:扩增目的产物条带较弱，或不能检测到相应条带。 解决：更换新鲜试剂，换用其他PCR机，重新计算TM值，应用降落PCR，优化MgCl2，模板DNA，dNTP的浓度，增加复性时间或设置更高的复性温度 B:多种扩增产物条带。 解决：优化引物的浓度，或重新设计引物 C:引物二聚体过量。 解决：应用降落PCR,最好结合热启动或加强PCR，或重新设计引物 酶切质粒载体与目的片段 2.1 酶切体系的优化[1] A:加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响 B:两种或两种以上限制酶切割DNA时，选择其通用缓冲液，若没有则可先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，再加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；或使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。 C:反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。 D:浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。 2.2 底物性质 A: