VIGS技术研究年终总结.pptxVIP

VIGS技术研究进展 汇报人：郭庆东 VIGS 一、VIGS的概念 病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。 二、VIGS的原理 VIGS 是利用植物对病毒的天然防御机制发展的瞬时、快速鉴定植物基因功能的技术，是从基因序列到功能的反义遗传学方法，也是转录后基因沉默(Post-transcript gene silencing , PTGS) 、RNA 沉默机制的一种表现，相似于线虫的RNA 干扰。 已在真菌、植物和动物的许多物种中发现了PTGS 过程的同源基因和酶，因此认为PTGS 机制在整个生物进化过程中是很保守的。目前关于基因沉默的假说认为，PTGS 包括3 个阶段：起始、维持和信号放大与传播。 二、VIGS的原理 双链RNA ( dsRNA )是基因沉默的起始因子. 第一阶段包括dsRNA 形成、识别和小干扰RNA ( siRNAs) 片段的产生, 由RNA 病毒复制机制、源于转基因的双向克隆形成的发夹RNA(hpRNA) 和反义RNA(asRNA) 克隆技术均可产生dsRNA ; dsRNA 被识别并被Dicer 酶从两端降解成21～23 核苷酸的siRNA。 二、VIGS的原理 在维持期，siRNA 与RNA 酶形成复合体即RNA 诱导沉默复合体(RISC)，后者具有RNA 同源性寻找活性和解旋酶活性以解旋dsRNA，该复合物可被解旋的siRNA 激活,鉴别单链siRNA 序列和降解互补的转录产物。 二、VIGS的原理 在第三阶段，上述形成的siRNA 作为信号被鉴别，在RdRp(RNA 依赖RNA 聚合酶) 引导下，siRNA 作为dsRNA 扩增的诱发子并以ssRNA (单链RNA)作模板，将沉默反应放大、增强，在这个过程中，siRNA 可能作为一种信号分子在植株中系统传播，诱导更多细胞启动PTGS，进一步放大了PTGS 效应。 原理图示 图1 VIGS 原理图 注: dsRNA: 双链RNA; Dicer 酶: 核糖核酸酶Ⅲ (RibonucleaseⅢ, RNase Ⅲ) 家族的成员; siRNA: 小干扰RNA ; RISC: RNA诱导沉默复合体 三、VIGS的优缺点 优点： 首先，在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下即可进行VIGS 分析。　　 其次，VIGS 操作简便，能快速获取表型。 第三，VIGS 无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难的植物种类来说至关重要。　 三、VIGS的优缺点 第四，VIGS 可用于突变致死的基因功能研究。 第五，VIGS 可用于功能冗余基因的功能研究。　　 第六，VIGS 可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究。 三、VIGS的优缺点 缺陷： 虽然VIGS技术短短几年中取得较大的发展，但此种技术目前仍然存在一定的缺陷。 首先，VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以致VIGS技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此种技术自身最大的局限性。 其次，如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术目前需要解决的问题。 三、VIGS的优缺点 第三，沉默持续的时间问题。 第四， 目前最稳定和最有效的VIGS载体都有一定的宿主范围限制， 其中绝大部分都只是在烟草和茄科植物(如番茄)中应用。 第五，病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较强的沉默效果，是VIGS技术实验操作中的关键性步骤。 四、VIGS技术的应用 第一个VIGS载体是由模式RNA病毒烟草花叶病毒( TMV)发展的。1995年Kumagai等在TMV上插入了一段PDS基因的部分序列，侵染本氏烟后成功地诱导了PDS基因的沉默。PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。PDS 表型变异易于辨别，因此PDS 基因成为VIGS 体系评价的参照基因。 四、VIGS技术的应用 由于VIGS的有效性和快速性，近些年将一些VIGS体系的载体进行改良，在特定的寄主植物上赋予新的功能，并且成功地用于解析许多具有重要意义的植物基因功能。其中，应用最多的就是基于TRV烟草脆裂病毒Tobacco Rattle Virus）的VIGS体系，并广泛用于验证重要经济作物的多基因沉默。 VIGS与小麦 在单子叶植物中可利用的载体是大麦条纹花叶病毒( Barley stripe mosaic virus, BSMV ) 改造的VIGS载体, 并在大麦上实现了八氢番茄红素脱氢酶( PDS) 基因的沉默。 Hein以BSMV 改造的病毒载体在大麦上验证了Mla