转运体临床前研究评价指得导标准以及实验方案.docVIP

转运体临床前研究评价的一些实验方案 FDA推荐主要研究的七个转运体及其底物、抑制剂 转运体 推荐特异底物 推荐特异抑制剂 P-gp/MDR1 地高辛、洛派丁胺、小檗碱、伊立替康、阿霉素、长春碱、紫杉醇、非索非那定 环孢霉素、奎尼丁、Tariquidar、维拉帕米 BCRP/MXR 米托蒽醌、氨甲蝶呤、拓扑替康、伊马替尼、伊立替康、他汀类、硫酸结合物、卟啉类化合物 雌（甾）酮、17β-雌二醇、fumitremorgin C OATP1B1 Bromosulphophthalein、oestrone-3-sulphate、oestradiol-17β-glucuronide、他汀类、瑞格列奈、缬沙坦、奥美沙坦、葡萄糖醛酸胆红素、胆红素、胆汁酸 沙奎那韦、利托那韦、洛匹那韦、利福平、环孢霉素 OATP1B3 Bromosulphophthalein、缩胆囊素8、他汀类、地高辛、非索非那定、替米沙坦糖苷、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、oestradiol-17β-glucuronide、胆汁酸 利福平、环孢霉素、利托那韦、洛匹那韦 OAT1 对氨基马尿酸盐、阿德福韦、西多福韦、齐多夫定、拉米夫定、扎西他宾、阿昔洛韦、替诺福韦、环丙沙星、甲氨蝶呤 丙磺舒、新生霉素 OAT3 Oestrone-3-sulphate、非甾体抗炎药、头孢克洛、头孢唑肟、利尿磺胺、布美他尼 丙磺舒、新生霉素 OCT2 N-Methylpyridinium、四乙铵、二甲双胍、心得乐、普鲁卡因胺、雷尼替丁、金刚烷胺、阿米洛利、奥沙利铂、varenicline 西咪替丁、吡西卡尼、西替利嗪、睾酮、奎尼丁 *底色为黄色的表示潜在临床可用。 七个转运体主要分布组织/细胞 转运体 主要分步组织及细胞 P-gp/MDR1 小肠上皮细胞、肾近曲小管、肝细胞（胆小管面）、脑内皮细胞 BCRP/MXR 小肠上皮细胞、肝细胞（胆小管面）、肾近曲小管、脑内皮细胞、胎盘、干细胞、乳腺 OATP1B1 肝细胞（窦状隙面） OATP1B3 肝细胞（窦状隙面） OAT1 肾近曲小管、胎盘 OAT3 肾近曲小管、脉络丛、血脑屏障 OCT2 肾近曲小管、神经元 外排转运体(P-gp、BCRP) 1.作用底物鉴定 FDA总体要求： 所有药物都需要进行鉴定是否为P-gp、BCRP的底物 流程如下： 注：1. P-gp 底物鉴定决策树对BCRP近似适用。 2. 除了传统双向转运评价方法外，表达P-gp/BCRP的外翻囊泡，固体支持物上的细胞单层（转染P-gp/BCRP、使用阳性对照），也可以运用到底物鉴定实验中。 2.抑制作用鉴定 FDA总体要求： 所有药物都需要进行鉴定是否对P-gp、BCRP有抑制作用。 注：1、P-gp 抑制剂鉴定决策树对BCRP近似适用。 2、除了传统双向转运评价方法外，表达P-gp/BCRP的外翻囊泡，固体支持物上的细胞单层（转染P-gp/BCRP、使用阳性对照），也可以运用到抑制剂鉴定实验中。 [I1]为临床最大给药剂量下所达到的最大稳态血浓；[I2]为临床最大口服给药剂量下将胃肠道容积视为250ml时药物在胃肠道的最大浓度。 实验方案： Caco-2细胞： 准备工作：Caco2细胞培养传代，选择对数生长状态细胞种板，培养21天，测细胞电阻以及做单层细胞模型验证实验（甘露醇以及地高辛） 双向转运实验： 用hanks平衡盐溶液(HBSS)将培养好的细胞洗涤2～3次。最后一次洗涤后测定跨上皮电阻值以监控细胞质量。然后在细胞层的基底面一侧( basolateral side, BL)换上HBSS, 在绒毛面一侧(apical side, AP)换上含有待测药物的HBSS, 以及相反操作, 在37℃恒温摇床中释药, 模拟体内吸收情况, 间隔一定时间取样。计算 表观渗透系数(Papp)计算公式为: 其中为渗透速率,Co为供药室中被测药物的初始浓度,A为细胞单层的表面积 计算Pb-a/Pa-b比值。 囊膜转运：（ABC转运体囊泡是从杆状病毒感染的昆虫细胞表达获得） 流程： 首先进行NME抑制性试验，得到NME的IC50值。（需要先考察需要特异底物浓度、转运实验时间） 可能产品说明书中能够提供案例说明上述考察项 然后进行NME底物确证实验（选用IC50值上下的两个浓度进行实验） NME抑制性试验过程： 底物+AMP 阳参+底物+ATP 底物+ATP+不同浓度考察药物（0μM及后续升高浓度） n=2 反应体系：可能产品说明书中能够提供。 后处理方法：加入0.2ml的冰冷缓冲液终止反应，转运液迅速抑制96孔滤板，通过F级玻璃纤维滤膜（0.7μm孔径）进行快速真空抽滤，滤膜冲洗后，加入0.2ml洗脱液，真空抽滤收集滤液。 评价方法：将药物浓度为0时的底物转运率记为100%，计算体系中加入