双向电泳的技术流程和样品制备-精选文档.ppt

双向电泳的技术流程和样品制备;基因组学与蛋白质组学;Applications of proteomics;蛋白质组分析的首要要求;生物学问题的提出;蛋白质组研究的基本技术路线;双向电泳分析中的样品制备;可溶性样品 ;样品的溶解;增加样品溶解性的手段;起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。;样品液的准备;;;;样品中核酸的去除;亚蛋白质组样品的制备;特殊样品的制备;强碱性蛋白质（如核糖体 ）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。 极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。 ;一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： ;IPG胶条的重泡胀;蛋白载样量;IPG胶条的蛋白质大约载样量;IPG IEF 中pH梯度的选择 ;预分步收集;聚焦时间的优化 ;IEF的基本条件;两维间的平衡 ;二维SDS;聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测;有机染料和银染;负 染;胶体扩散染料;有机荧光团染料;金属螯合染料;凝胶的图像处理分析和;蛋白质的胶内酶切;质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 ;实验方法 完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）;体外 pmol;非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。 变性2D：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡，然后进行SDS。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式