课件：酶蛋白的结构.ppt

8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序 至此，已经得出了多肽链被断裂成的各个肽段的氨基酸顺序，但由于没有这些肽段在多肽链中次序的信息，还是无法排出整个多肽链的氨基酸顺序。为此，必须用两种或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如用两种蛋白酶分别水解多肽链，将得到两套断裂位点不同的肽段，分别确定这两套肽段的氨基酸顺序，然后利用这两套肽段的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可以确定整条多肽链的氨基酸顺序。 通过末端分析得到：N-末端残基为I，C-末端残基为L 用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，测定出氨基酸顺序分别为： MTYAGK ISR EAL CAFR DALK 用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，测定出氨基酸顺序分别为： TY REAL AGKDAL ISRM KCAF 由于N-末端残基为I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又由于C-末端残基为L，EAL和REAL是C-末端肽段。利用两套肽段的氨基酸顺序彼此之间的重叠关系，得出： 第一套肽段： N-末端 ISR MTYAGK DALK CAFR EAL C-末端 第二套肽段： N-末端 ISRM TY AGKDAL KCAF REAL C-末端 推出完整肽链顺序： ISRMTYAGKDALKCAFREAL 在上例中，两套肽段之间正好能够相互跨过切口而重叠，从而能确定出肽段在多肽链中的位置，拼凑出整条肽链的氨基酸顺序。 9. 多肽链中二硫键位置的确定 对于含有二硫键的蛋白质，我们在分析多肽链氨基酸顺序前先将其拆开，然而在测定完多肽链氨基酸顺序后需要确定链内和链间二硫键的位置，常用的方法是对角线电泳法。不拆开二硫键直接用蛋白酶水解蛋白质，所得肽段样品点样到滤纸中央的电泳原点，在第一个方向上进行电泳，则不同的肽段按其所带电荷和分子大小分离。结束后将滤纸在过甲酸蒸气中熏，二硫键被氧化和拆开。将滤纸旋转90°，在相同条件下进行第二个方向上的电泳。这时，对于不含二硫键的肽段，由于没有发生变化，电泳迁移率不变，电泳后位置应处于对角线上；而含有二硫键的肽段，其大小和电荷发生了变化，电泳迁移率也要改变，电泳后位置偏离对角线，将这些肽段提取出来，进行氨基酸顺序分析，与已经测定的多肽链氨基酸顺序相比较，即可推断出二硫键的位置。 除了上述经典的蛋白质一级结构测定方法外，由于核苷酸序列测定技术发展迅速，目前DNA的核苷酸序列测定已完全实现自动化，而蛋白质的氨基酸顺序是由DNA所决定的，人们通过提纯指导蛋白质合成的mRNA，再将mRNA通过逆转录作用得到cDNA，并扩增cDNA，然后测定其核苷酸序列，根据三联体遗传密码规则可确定出蛋白质的氨基酸顺序。 到目前为止，已有10万种以上的蛋白质完成了一级结构的测定，对于大多数常见蛋白质，通过查阅数据库，可得到关于一级结构的资料。 第二节 蛋白质空间结构的研究方法 二级结构：a-螺旋（a-helix) ；b-片层(β-sheet) ； b-转角(β-turn) ；无规卷曲(random) 维持键：氢键、疏水键、范德华力、离子键、配位键等 R基团对a-螺旋的影响：a) 构成a-螺旋要求R不太大，不带电荷 b）几个相连的氨基酸的R带同种电荷，不形成a-螺旋 c）R带电荷但间断，可形成a-螺旋 *φ= -57°，Ψ= -47°是形成a-螺旋的条件，不满足此条件不能形成a-螺旋 *Gly不参与a-螺旋，原因：Gly的a-C上连两个H，故φ、Ψ无法确定 *Pro、Hyp不参与a-螺旋，原因：不形成φ角；空间障碍不形成氢键 φ= -119°，Ψ= +113°时，蛋白质分子成平行的b-片层 φ= -139°，Ψ= +135°时，蛋白质分子成反平行的b-片层 从能量上看，反平行式要比平行式更稳定。 三级结构 二级结构进一步卷曲形成,具有三级结构的蛋白一般为球形或椭球形 纤维蛋白具有超二级结构(超螺旋) 四级结构 具有独立的三级结构间的结构 晶体蛋白测定 X光衍射——古老的方法，1958年英国科学家开始运用，分辨率6A0，目前分辨率1.4A0，我国X光衍射仪分辨率1.8A0，测胰岛素结构。 缺点：只能测晶体，不能测溶液。 不能测氢原子位置，故测不出氢键的作用。 只能测静态酶结构，无法测酶催化反应的动态。 目前有较新的实验方法——中子衍射。 溶液中构象的测定 a) 紫外吸收法（常用方法）：Try，Tyr，Phe在紫外波长范围有最大光吸收，产生紫外吸收光谱。受pH、溶剂或邻近分子、邻近发色团的相对取向影响。 目前用紫外吸收法可以探讨下列问题： 芳香族氨基酸在表面？在内部？极性环境？非极性环境？数量？(氨基酸由极性到非极性，λ