课件：酶切回收连接.pptVIP

基因工程的基本过程 分 切 接 转 筛 表 质粒DNA的酶切 定义：识别dsDNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 限制性核酸内切酶 Ⅱ类内切酶作用特点 能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构 （180度旋转对称结构） Hind Ⅲ 产生5??粘性末端 A AGCTT TTCGA A AAGCTT TTCGAA Sst Ⅰ GAGCTC CTCGAG 产生3粘性末端 GAGCT C C TCGAG 粘端切口 GTC CAG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 3、命名： Hind Ⅲ Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序 书写方法：前3个字母斜体 酶活性单位 指在限定条件下（温度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。 实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。 酶切反应系统的设计 回收DNA通常酶切10μg 实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。 酶通常保存在50%的甘油中 ，使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释10倍。 Buffer通常是10×，使用时稀释10倍。 总反应体积20-50ul，不足用tdH2O补足。 DNA的量 酶的用量（U/C） 酶在50％甘油中，甘油在总体积的浓度要小于5％ 反应的总体积 Buffer的体积 水的体积 质粒DNA 15μl （10μg） Hind III (20U/μl) 1.5 μl 10 × 缓冲液 E 3μl 三蒸水 9μl _____________________________________ 总体积 30μl XbaI（20U/μl 1.5 μl 加样顺序 加样后混匀，短暂离心，使之至管底。 DNA片段的分离纯化 四、操作步骤： 关键操作：点样 在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿孔底 加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到tip中，使加样失败 载体 DNA 目的基因 bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M 酚抽提法 切下含目的DNA的胶块。 加入酚，将胶块没过即可。 振荡后低温冻结，视温度而定时间。 30℃水浴融化，若体积小，可补加TE。 振荡器上振荡。 12,000 rpm离心5 min。 取上清200μl。 用200μl的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000 rpm，5 min，取上清）。 加20 μl NaAc，400 μl无水乙醇沉淀DNA，冰冻约30 min甚至过夜。 12,000 rpm离心10 min，弃上清。 将DNA溶于约30μl TE中。 DNA片段的连接反应 DNA 连接酶 ligase 催化DNA 5 磷酸基与 3 羟基之间形成磷酸二酯键(ATP) 5 5 3 3 OH P OH P DNA连接酶 DNA连接酶 总体积20 μl 载体 0.1~0.2μg 目的基因：载体mol数= 1～5：1 H2O 10×buffer 载体 目的基因 ligase 总体积 20μl μl μl μl μl μl 连接应注意的事项： 目的基因与载体的mol数之比 连接酶的buffer：溶解充分，分装，防止ATP降解 温度：4~8℃最好。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设