课件：实验三枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析.ppt

枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析 2008.12.05 实验目的 从枯草芽孢杆菌中分离提取碱性磷酸酶 进行酶活分析 实验原理 碱性磷酸单酯酶（EC:3.1.3.1）又称碱性磷酸酯酶，碱性磷酸酶，官方英文名为Alkaline phosphatase 碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。 其用途一般有：1）在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸。2）去除DNA片段5’磷酸以防止质粒DNA连接和自身环化。 最适温度37℃，最适pH10，对底物只具有相对的专一性，在碱性条件下水解磷酸酯： 单磷酸酯＋水 醇＋磷酸 高浓度盐溶液处理MgCl2 破壁抽提 透析 处理 纯化 硫酸铵 处理 盐析除 杂蛋白 盐析 根据不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同而利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出的方法称为蛋白质的盐析。 实验材料 枯草杆菌发酵液 Tris－HCl缓冲液（pH7.4、9.5） 1mol/L MgCl2 溶液 40mmol/L 对硝基酚磷酸（NPP）溶液 实验步骤 细胞培养与收集每组取约50mL枯草杆菌发酵液8000rpm离心5min，收集菌体弃去上清。用pH7.4的Tris－HCl缓冲液洗涤菌体一次并弃去上清。 碱性磷酸酶的提取得到菌体沉淀后，每管加入5mL pH7.4的Tris－HCl缓冲液，使细胞重悬。然后再加入1mL 1mol/L MgCl2 溶液，于室温振荡10min；8000rpm离心5min，取上清液即为粗酶液。取样测酶活。 硫酸氨盐析将上述粗酶液，缓慢加入硫酸铵粉末，使之达到50％饱和度（313g/L），12000rpm离心5min，去除杂蛋白沉淀。取上清液，再加固体硫酸铵，使之浓度分别达到70、75、80、85、90％ 充分溶解后，12000rpm离心5min。得到粗酶沉淀。 透析处理沉淀用2mL pH7.4的Tris－HCl缓冲液溶解，装进透析袋，在室温下透析1周。取样测定纯品酶活。 酶活测定 溶液 加量 pH9.5 Tris－HCl缓冲液 750μ L NPP 250 μ L 样品 0.5ML 37℃保温10min 0.5mL 0.5M NaOH 终止反应 稀释至10mL 酶活力单位：在420nm波长吸光度每变化0.001定义为酶的一个活力单位。 实验结束 卫生大扫除 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * * * * * * * * * *