课件：血清蛋白的醋酸薄膜电泳.ppt

4．定量 本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤： 取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4 mol/L氢氧化钠4 ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约0.5 h后，用分光光度计进行比色，波长用650 nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白A，α1，α2，β，γ球蛋白各管的吸光度。 5．计算 吸光度 ∑T＝A＋α1＋α2＋β＋γ 各部分蛋白质的百分含量为： 白蛋白％＝（A / ∑T）×100％ α1球蛋白％＝（α1/ ∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2/ ∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/ ∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/ ∑T）×100％ 【实验思考】 1．电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 2．电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成分？请分析原因。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * * * * 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白 【实验目的】 1、了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术； 2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法。 实验六 【实验原理】 由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在pH 8.6的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的相对分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。 血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。 例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白（如图3-5）。 图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。 此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。 【实验材料】 1．电泳仪 包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。 2．醋酸纤维素薄膜。 ⑵ 试剂 4 试剂 ① 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子强度0.06)称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。置40C保存，备用。 ② 血清蛋白染色 染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。 漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸馏水50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。 ③透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 ④保存液：液体石蜡。 ⑤定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）： 称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。 【 实验方法与步骤】 4 实验方法与步骤⑴ 仪器与薄膜的准备 1、仪器与薄膜的准备 ① 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。 将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。 ② 电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。 在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对