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核酸环介导等温扩增技术（LAMP）引物设计与实例Time：2009-12-07 PM 14:52　　Author:bioer　　Hits: 1459 times 　烟头整理 LAMP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单 LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 (2)快速高效 因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg/mL。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 (3)高特异性 由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 (4)高灵敏度 对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 缺点： 由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。 引物设计实例 LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。 以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP引物设计的过程： 首先单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于22 kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。 第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计LAMP反应的引物。 　　在进行LAMP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑： 1. 引物之间的距离 　　F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。 F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。 F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。 2. 引物的Tm值 　　引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration)、寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。 　　例如：寡核苷酸的浓度为0.1μmol，钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4 mM等。 　　Tm(退火温度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+] 　　式中，Tm为退火温度，℃；为摩尔气体常数，1. 987ca1/℃?mol ； △H为焓变；△s 为熵变；C为寡聚核苷酸的浓度；[Na+]为钠离子浓度。 　　对于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值为60~65℃，而对于AT富集的引物Tm值为55~60℃。在设计引物的时候，F1c和B1c的Tm值大概是65℃(64~66℃), F2,B2, B31的Tm值大概是60℃(59~61℃)。 3. 引物末端的稳定性 　　引物的末端作为DNA合成的起点必须有一定的稳定性，自由能改变值(△G)是指反应物的自由能与产物的自由能之差，反应朝着自由能减小的方向运行。引物和目的基因之间的退火反应是一个动态平衡的反应，自由能改变值(△G)越小，引物与模板之间的退火反应越容易发生。 　　一般在进行引物设计的时候，F2/B2\F3/B3的3’端和F1 c/B1c的5’端的自由能改变值小于或等于-4Kcal/