实验一血涂片的制作及到免疫细胞的形态观察.pptVIP

实验一 血涂片的制作及免疫 细胞的形态观察 一、实验目的 学习掌握血涂片制备和染色方法; 比较观察各种免疫细胞的形态。 二、实验原理 血涂片是血液学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本。为观察细胞内部结构，识别各种细胞，血涂片必须进行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏（Wright）染色法衍变来的。目前常用瑞特氏染色法。 瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。 因此，经瑞氏染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。 三、实验用品 实验材料： 酒精棉球、载玻片、眼科镊、眼科剪等。 试剂： 瑞氏（Wright）染液。 四、实验步骤 １.准备洁净玻片两张，一张用于推片，另一张用于固定标本。 ２.剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制备血涂片，自然干燥。 涂片 将一滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以30-40度为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。 3．瑞氏染色 待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止，染色1min。 染1分钟后，再加等量的缓冲液或蒸馏水于染色液上，吹匀,浸染约8-10分钟。 用蒸馏水迅速冲洗。待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检 脱色：用20%盐酸甲醇脱色，肉眼观察玻片呈粉红色为宜，显微镜下观察结果。（省略） 4．观察 　　分别用低倍、高倍镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。 淋巴细胞 颗粒细胞（嗜酸性、嗜碱性、嗜中性） 单核细胞 红细胞与血小板 五、实验结果 　　绘图并比较几种免疫细胞的形态特征。 红细胞 血小板 未成熟中性粒细胞 大淋巴细胞 成熟的中性粒细胞 嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞 单核细胞 血涂片 血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质与酸性染料伊红结合染粉红色称为酸性物质； 细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色称为嗜碱性物质； 中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色称中性物质 neutrophils lymphocytes monocytes Basophils, eosinophil 　　1.瑞氏染液:瑞氏染料1g加甲醇(AR)600ML。将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵中,加少量甲醇,充分研磨使染料溶解.将已完全溶解的部分倒入棕色试剂瓶中,未溶解部分再加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解于甲醇为止。新配制的染料偏碱,须在室温和37℃下一定时间待染料成熟,主要美蓝逐渐增多为天青B后才能使用.贮存时间越久染色效果越好,因此,Deamgilliland等采用吸光度比值(rA)作为瑞氏染料的质量规格.rA测定方法如下:取瑞氏染液15-25ul(视染液浓度而定)加甲醇10ml稀释,混匀后以甲醇为空白管分别以波长650nm,525nm比色,rA=A650/A525。因为美蓝吸收峰为波长650nm,伊红吸收峰波长为525nm,天青B吸收峰也为650nm,但吸光度A约为美蓝的一半.所以新配制染料的RA接近2,随着美蓝逐渐氧化为天青B,RA也相应下降,RA下降达1.3±0.1即可使用.瑞氏染料在贮存过程中必须塞严,以防甲醇挥发和氧化为甲酸.有人主张配方中加入30ml甘油,防止甲酸挥发,并可使细胞染色清晰.甲醇必须纯净,如甲醇中丙酮含量过多,染色偏酸,使细胞着色不良。磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8)：磷酸二氢钾0.3g加磷酸氢二钠0.2g再加蒸馏水至1000ml,配制成磷酸盐缓冲液调整PH,如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。 * 血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白质与酸性染料伊红结合染粉红色称为酸性物质； 细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色称为嗜碱性物质； 中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色称中性物质. * 血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落,因此血膜必需充分干燥. 染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件. 　　6) 染液不可