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pGEX-4T-3- pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化及多克隆抗体的制备 水生呼肠孤病毒是水域生态环境中广泛存在的一类病毒，其中草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是在1991年被国际病毒分类委员会(ICTV)分到水生呼肠孤病毒属，是由中国分离鉴定的第一株鱼类病毒[1]。GCRV是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量以糖蛋白的形式存在的糖类，不含脂类[2]。草鱼自古以来就是中国池塘养殖的当家品种，而GCRV被认为是水生病毒中对草鱼毒力最强、致病死亡率最高的病毒之一，该病毒引起的出血病不仅直接危害鱼体，而且会激发细菌性“三病”的发生，使草鱼的成活率降低到40~50[3]，甚至只有10%左右[4]，给中国的草鱼养殖业造成了很大的危害和困扰。草鱼病毒性出血病，主要侵染于草鱼心脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾、鳃、肠道等组织，且化学药物很难达到治疗效果，为了给草鱼养殖增产和减小不必要的经济损失，找到有效防治GCRV的方法显得尤为重要。 GCRV基因组含有11条双链RNA(dsRNA)，其分段基因组RNA的3 端不含poly(A)尾巴, 在5’和3’末端各含有特异的重复保守序列，为5’-GUUAUU和3’-UCAUC。11个片段根据凝胶电泳迁移率可分为3组，即大片段(L1,L2,L3)、中等片断(M4,M5,M6)、较小片段(S7,S8,S9,S10,S11)。GCRV共编码5 种非结构蛋白, 分别是NS16、NS26、NS31、NS38、NS80[5]。病毒的非结构蛋白在病毒的复制过程中发挥重要作用。其中NS26是由S11编码的，含有244个氨基酸残基，分子量为26.4KD, 是水生呼肠孤病毒特有的蛋白质, 没有同源蛋白，含ATP-依赖性的RNA解螺旋酶功能性位点[6]。 国际上对GCRV编码蛋白的功能(尤其是非结构蛋白的功能)方面的研究还不够系统和全面；但根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则，除非结构蛋白NS26外，GCRV各蛋白在病毒复制周期中的地位和作用已经初步明确[7]。因此，研究S11表达的非结构蛋白NS26的免疫原性，并对其多克隆抗体进行分析，以期为今后研制草鱼亚单位疫苗做好坚实铺垫。 课题组从草鱼养殖场患出血病的病鱼体中分离到一株具强致病力的病毒株，命名为GCRV-GD108[8]。本研究采用基因工程的方法，从感染GCRV-GD108的草鱼肾脏细胞CIK中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR扩增了S11基因，通过TA克隆连接至载体pMD-19-T中，构建了重组载体pMD-19-T-S11，再将重组载体pMD-19-T-S11双酶切连接至表达载体pGEX-4T-3，构建了重组表达质粒，酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒在大肠杆菌BL-21中进行高效表达，用IPTG诱导获得了可溶性重组蛋白，采用GST亲和层析和凝胶过滤层析的方法对重组蛋白进行纯化，获得融合蛋白，利用SDS及Western blotting检验融合蛋白。采用纯化后的含有GST的融合蛋白免疫日本长耳大白兔制备多克隆抗体，ELISA法测定血清抗体的效价。 1.1实验材科与实验仪器 1.1.1菌株、质粒和细胞 草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108，感受态细菌DH5α和BL-21，原核表达载体pGEX-4T-3和pMD-19-T，草鱼肾脏细胞（CIK）为本实验室保存。 1.1.2实验试剂 DNA限制性内切(BamH I和XhoⅠ)，Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Fragment Purification Kit，DNA Marker和Agarose Gel DNA Purification Kit，低分子量蛋白Marker和异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG)购自大连TaKaRa生物工程有限公司。Turbo Script逆转录第一链cDNA合成试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司；GSTrap亲和柱购于GE Healthcare公司；还原型谷胱甘肽为Merck公司分装；PCR引物合成和重组质粒的测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal )、过硫酸铵、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、溴化乙啶(EB)、二硫苏糖醇(DTT)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。一抗anti-GST, HRP一羊抗兔IgG酶标二抗均购于天根生物科技有限公司。琼脂粉，酵母提取物和胰蛋白胨购自于Oxoid公司。溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250购买于鼎国生物技术有限公司。 其余试剂氯化钠、氢氧化钠、氯化钙、冰醋酸、甲醇、乙醇等均为国产