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2019-07-08 发布于江苏
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细胞代谢呼吸动态分析仪操作流程实验前一天：将探头水化，带有荧光物质的干燥探头在水化液中浸泡过夜，充分膨胀，可使测定结果更准确。0.6ml/孔。在无二氧化碳的37℃环境，避光放置过夜。（若水化超过24h则要用封口膜将盖子边缘封住）铺细胞，以Hela细胞为例，40-50k细胞/100ul/孔，细胞要铺均匀，铺好后轻轻拿到培养箱，不要晃动，避免边缘密集，中央稀疏的情况。注意加入细胞时枪头的角度（倾斜45度），一定不要产生气泡。 5h后每孔补加150ul生长培养基。 × × × × 打叉部分做为背景校正孔，不铺种细胞。实验日：在开始实验前1h处理细胞，用无缓冲检测液给细胞换液。 250ul生长培养基：吸出175ul 加入600ul检测液吸出600ul检测液重复步骤2-3 加入450ul检测液，总体积为525ul。放入无CO2环境，37℃培养1h。注意枪头不要戳到细胞。配置mito stress kit Oligomycin、FCCP、Antimycin/Rotenone 各加180ul DMSO，浓度2.5mM，分装30ul/管。取6.4ul oligomycin +2ml检测液 1uM （A）取7.2ul FCCP +2ml 检测液 1uM （B）取 Antimycin/rotenone 各8ul+2ml 检测液（C）将 A、B、C分别加入上样孔，75ul/孔。上样顺序： D C B A 选择“assay wizard”开始设程序。耗氧：100ml h2o +0.83g D5030 + 0.37g NaCl 10mM glucose 2.5mM 丙酮酸 37℃调pH7.4 糖酵解：100ml h2o+0.83g D5030 + 0.37g Nacl 37℃调pH7.4 （不要加任何底物） A 10mM glucose （80mMstock） B 1umoligomycin （9um Stock） C 50mM 2-DG （500mM stock）注意事项：在放置探针板时，将板子缺角向右下方放置，并将Cartridge的透明盖子拿掉，避免探针损坏