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实时荧光定量 PCR 具体实验步骤 1 样品 RNA 的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈 振荡管体 15 秒后，15 到 30℃孵育 2 到 3 分钟。4℃下 12000rpm 离心 15 分钟。离心后 混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。 RNA 全部被分配于水相 中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。 ③RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀 其中的 RNA ，混匀后15 到 30℃孵育 10 分钟后，于 4℃下 12000rpm 离心 10 分钟。此 时离心前丌可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA 清洗 移去上清液，每 1mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1ml 的 75%乙醇 （75%乙醇用 DEPCH O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4℃下 7000rpm 离心 5 分钟。 2 ⑤RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。 ⑥溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次，使其完 全溶解，获得的 RNA 溶液保存于-80℃待用。 2 RNA 质量检测 1 ）紫外吸收法测定 先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100 ）后， 读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260 下读值为 1 表示 40 µg RNA/ml。样品 RNA 浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释 倍数 × 40 µg/ml。具体计算如下： RNA 溶于 40 µl DEPC 水中，取 5ul ，1:100 稀释至 495µl 的 TE 中，测得 A260 = 0.21 RNA 浓度 = 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl 取 5ul 用来测量以后，剩余样品 RNA 为 35 µl ，剩余RNA 总量为： 35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg ②纯度检测 RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。 2 ）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g 琼脂糖溶于 72ml 水中，冷却至 60℃ ，10 ml 的 10× MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS 电泳缓冲液 浓度 成分 0.4M MOPS ，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 µl 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽 内，加足量的 1×MOPS 电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ②准备 RNA 样品 取 3µgRNA ，加3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为 10µg/ml。 加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。 ③电泳 上样前凝胶须预电泳 5min ，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm 电压下 2h ，电泳至溴酚兰 指示剂进胶至少 2–3cm。 ④紫外透射光下观察并拍照 28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型），上 面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由 低分子量的 RNA （tRNA 和 5S 核糖体 RNA ）组成。在18S 和 28S 核糖体带之间可以看到 一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果 出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或 者带，RNA 的降解表现为核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3 样品 cDNA 合成 ①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录 buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆转录酶 MMLV 0.5μl 6 DEPC 水 5μl 7