酵母菌的简单染色和血细胞计数板计数.pptVIP

实 验 五;实验目的; ; 显微镜计数法：显微镜计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上（又称计菌器），与显微镜下观察、计数的方法。 计菌器种类：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器、Hawksley计菌器（基本原理相同）; 实验原理一 血细胞计数板（最常用也是本实验所用）：较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分9个大方格，中央的一大方格作计数室。; 计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。;;计数时，通常数5个中方格的总菌数（四角中格及中间中格），然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格的总菌数，然后在换算成1ml菌液中的总菌数。 以25个中方格的计数板为例，设5个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则 1ml菌液中的总菌数=A/5×25×104×B;实验步骤一 1、检查血细胞计数板 在加样前，对计数室进行镜检。若有污物，可用自来水清洗，再用95%的乙醇棉球轻轻擦洗。然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。 注意：计数板上的技术室的刻度非常精细，清洗时切勿使用刷子等硬物，也不可用酒精灯火焰烘烤计数板。 2、加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释摇匀的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生，静置5—10分钟即可计数。 ;3、显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。 遵循“数上不数下，数左不数右”的原则。 计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 ;4、清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 ;实验原理二;; 实验步骤二 美蓝染液水浸片法 1、滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，于酿酒酵母合成培养基中蘸取少量菌体置于染液中混合均匀。 2、用镊子取一片盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。 3、低倍镜及高倍镜镜检：将制片放置3分钟，观察酵母菌形态和出芽情况，并根据颜色区分死活细胞。 4 、染色30分钟后再次观察注意死活细胞比例是否发生变化。 ;获得本次实验成功的关键 ⑴ 活细胞是透明的，因此在进行显微镜计数应适当减低视野亮度，以增大反差。 ⑵进行显微计数时应现在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中心，再换高倍镜观察和计数。 ⑶用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 ⑷滴加染液要适中，否则要盖玻片覆盖时。染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。⑸ 盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。;your time