实验九流式细胞六术分析细胞凋亡和细胞周期时相.pptVIP

实验九 流式细胞术分析细胞凋亡和 细胞周期时相 杭州师范大学 刘姬艳 一、实验目的 1、了解流式细胞术（FCM，Flow Cytometry） 的基本原理。 2、了解流式细胞术分析细胞凋亡的检测方法。 3、了解流式细胞术分析细胞群体DNA含量分布 的基本方法。 二、实验原理 ● 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)。 ● 细胞凋亡有别于细胞坏死（necrosis）。 二、实验原理（continued） 细胞凋亡的形态学特征 二、实验原理（continued） 细胞凋亡检测方法 基于形态学观察的染色法 基于DNA 片断化的检测法 膜联蛋白检测法 Caspase酶分析法 流式细胞仪定量分析法 二、实验原理（continued） ● 流式细胞术（FCM，Flow Cytometry）：是对单个 细胞或其他生物微粒进行快速定性, 定量分析与分选 的一门技术。 ● FCM是利用流式细胞仪(Flow Cytometer)分析在高压 高速下通过样品孔径的单个细胞, 在激光束的照射下 的发出的散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗 的荧光信号。 二、实验原理（continued） ● 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如 G0/G1期的DNA含量为2n，而G2期的DNA含量是4n。利用 PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量 进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。 流式细胞仪-Guava Easycyte 8HT 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理（continued） 二、实验原理 二、实验原理 二、实验原理 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：Hep-2细胞，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂： 70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,- 20℃保存），PI （650μg/ml，避光保存于-20℃）， PBS(pH 7.4，保存于4℃) 三、仪器、材料与试剂 收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9mL（含4×105细胞）。 培养过夜后，加入不同浓度的药液100μL，对照组加入同体积的高糖DMEM液。 作用不同的时间后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，体积分数为0.70的乙醇-20℃固定24h以上。 离心洗去乙醇，细胞重悬于PBS中，1,500r/min，离心5min去PBS后加PI染色液，室温下避光染色30min。 400目筛网过滤，采用Guava Easycyte 8HT流式细胞仪，以氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细胞DNA含量。 四、实验步骤 五、实验结果 五、实验结果 五、实验结果