westernblot总结前人的经验.pptx

Western blot; 实验的原理;实验室所用的试剂的配方参考TAKARA分子实验常用配方手册;蛋白样品的制备 SDS 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 ;蛋白样品的制备;3 .对于悬浮细胞，2500g离心5min收集细胞，用 PBS、生理盐水或无血清培养液漂洗细胞，2500g离心5min收集细胞,加入适量裂解液. （约为细胞体积的 5-7 倍）。用移液器吹打数下，把细胞吹散，冰上孵育20min，14000g 离心 10 分钟，取上清，即为 蛋白提取物。 对于组织样品： 1.手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组 织表面液体，将组织称量后切成几个较小的组织块放入匀浆器中。 2.取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1x。 3.按组织净重（g）：裂解液(ml)=1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆(如果裂解 不充分可以适当添加更多的裂解液, 如果需要高浓度的蛋白样品, 可以适当减少裂解液的 用量) 。 4.匀浆器匀浆,冰上孵育 20min，直至充分裂解。 5.充分裂解后, 14000g 离心 10 分钟,取上清,即为蛋白提;蛋白浓度的测定; (5) 加样品：加 2μl 样品到 96 孔板的样品孔中，加 18μl PBS(好用 1%SDS 或裂解