1DNA的提取,核酸的琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

实验一、 DNA的提取，核酸的琼脂糖凝胶电泳 主要内容 1、基因组DNA的提取； 2、核酸的琼脂糖凝胶电泳 应达到的基本要求或能力标准 掌握DNA提取原理与方法；核酸的琼脂糖凝胶电泳原理与方法 1. DNA提取 ??天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。 在浓氯化钠（1-2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（0.14mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 1.1 DNA提取原理 ??CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中结合核酸、沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。 阴离子去污剂 （如 SDS,十二烷基磺酸钠）处理核蛋白，DNA（或RNA）即与蛋白质分开，酚-氯仿-异戊醇处理，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量有机物（乙醇或异丙醇 ），DNA即析出。? ? DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 三羟甲基氨基甲烷（Tris） (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; EDTA螯合Mg2+、Mn2+离子,抑制DNase活性; NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中; 异戊醇能消除抽提过程中出现的泡沫 70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等 ? 反复冻融法 ? 超声波处理法 ? 冷热交替法 ?有机溶剂处理法 ? 去污剂 ? 溶胀法 DNA的纯化采用不同方式，主要有沉淀法和固体介质吸附法。 沉淀法是用试剂乙醇和异丙醇等沉淀浓缩DNA，在DNA沉淀过程中可使用DNA共沉淀剂如糖原、PEG或tRNA以提高DNA的得率。 固体介质吸附法是指采用阴离子交换树脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。 提取DNA时，可同时采取几种纯化方法。 1.2. DNA提取操作 康为世纪柱式基因组提取试剂盒（CW22978） 2. 核酸琼脂糖凝胶电泳 2.1. 核酸琼脂糖凝胶电泳的原理 在pH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。 DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片断。琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。 溴化乙锭(EB)可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。 2.2. 核酸琼脂糖凝胶电泳的操作 (一）、制胶1．称取0.4g（适量）琼脂糖置于三角瓶中，加入50ml 0.5×TBE(或1×TAE) 缓冲液。2．微波炉加热，煮沸、振摇，反复加热、振摇2-3次，使琼脂糖充分融化。3．胶带将胶床两端粘好，底部粘严，以防凝胶渗漏，插好梳子。4．待胶冷却至60℃左右时，将融化的琼脂糖小心地倒入胶床中，速度要快，除去气泡，让 胶自然冷却至完全凝固（约需要20-30分钟）。5． 小心向上方拔出梳子，避免前后左右摇晃，以防破坏胶面及加样孔，去掉制胶槽两边的胶带，小心将胶和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。6． 向电泳槽中加入0.5×TBE (或1×TAE)电泳缓冲液，液面高于胶面约1-2mm。 （二）、上样电泳1、取2μl上样液（溴酚蓝指示剂）于Parafilm上，加2μl水与2μl样品DNA反复吹吸，混匀。2、Tip头垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中。3、接通电源，打开开关，电泳开始以正、负极铂金丝有气泡出现为准(一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm )。4、根据指示剂迁移的位置，判断是否中止(跑过胶板的2/3 )。切断电源后，再取出凝胶。5、凝胶取出后于含EB的溶液中染色20分钟。 （三）、凝胶紫外观察：染色后的凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。 注意事项1. 琼脂糖融化时，档位不宜太高。2. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。4. 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。5. 电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6. 电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。 * 1.1 DNA提取原理