课件：HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用.ppt

为什么要作内对照： PCR放大公式：（1＋X）n X1 n=30 （1＋0.9）30 = （1＋0.8）30 = 扩增管中同时对样本和定量标准（QS）进行扩增。在主要反应液（Master Mix）中有生物素标记的一对引物能扩增样本和定量靶核苷酸标准（QS）。样本和（QS）的引物结合区相同，但探针结合位点不同，因此样本扩增产物和和（QS）扩增产物可以被彼此区分。 将已知拷贝数的QS参入到每个待测定标本中，并和标本经受同样的标本处理过程、逆转录/扩增或扩增过程、杂交和检测过程。 标本中的DNA、RNA数量是通过比较样本讯号和QS讯号而得出的，因此QS补偿了扩增过程中的抑制影响，并起了对照作用，从而可以准确的测出样品的定量结果。 In the automated Cobas Amplicor version, detection is carried out using probes-coated magnetic particles as for the other qualitative and quantitative, monitor, assays. The sensitivity of Amplicor HBV Monitor may help in a assessing the efficacy of anti-viral therapy by predicting the probability of patients‘ response to treatment during the early phase, the occurrence of drug-resistant associated mutations and of HBsAg clearance. Moreover, in the liver transplantation setting viral load can be used to predict the rate of re-infection and guide preemptive therapy. These information can not be achieved with traditional hybridization-based assays (bDNA, Abbott or Digene) because of their limited sensitivity. * * * 均采用外部标准曲线定量，标准品为重组质粒，与临床标本有无差异－－？ 质控品及标准品有无朔源性－－？ 试剂是否标明“域值”或“Cross Band” 取值范围－？ 阳性质控是否给出标准值范围－－？ 标准品浓度是否覆盖声明的检测灵敏度－－？ 是否提供内部质控品－－？ 纯化产率如何控制－－？ 需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题 检测结果标准化的问题 标准化的各要素 校准品 试剂 分析仪 为什么进行HBV DNA检测 HBV DNA检测带给我们的益处 目前HBV DNA的检测方法 罗氏COBAS Amplicor系统的优点 新一代技术COBAS TaqMan 主要内容 COBAS Amplicor 检测原理 杂交 (37 C) PCR扩增 变性 杂交 清洗 加AV-HRP 加TMB 内部标准品(QS)全程监控样本制备/PCR过程兼作定量参照 B B B B 内部标准品 DNA 模板 DNA 模板 DNA 内部标准品 DNA COBAS Amplicor： 与固定在磁珠上的探针杂交 内对照防止假阴结果，精确定量 PCR COBAS AMPLICOR HBV Monitor特点 检测下线300 copies/mL, 95% 检出率 线性范围 300- 200,000 copies/mL 同等定量亚型 A-F 血清或血浆 100 ul 样本 6 小时检测时间, 30 分钟手工准备 内部定量标准 防污染系统 COBAS Amplicor VS bDNA COBAS Amplicor vs bDNA COBAS Amplicor vs bDNA Cobas Amplicor bDNA 标本准备 乙醇沉淀 磁珠吸附 扩增 靶序列 光信号 线性范围 300－200,000 2000-100,000,000 特异性 100% 99.2%（96-98%) 亚型 A－F A－F 污染控制 有 无 定量方案 内部标准品 外部标准曲线 Control数量 3个 12个 报告