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50L发酵罐的使用——发酵过程与控制实验报告 学院：生命科学学院 班别：XXX 姓名： XXX 学号：XXX 实验目的 认识全自动生物反应器的安装和准备，反应后的拆卸和清洗等；了解pH电极和溶氧电极（DO）的结构及基本原理；掌握pH电极和溶氧电极的校正方法；认识发酵罐培养基的灭菌，认识反应器在位高压灭菌的方法和规程，学会反应器培养液灭菌过程中的升温、保压、降温和培养温度的设定等操作；掌握接种的方法及操作，确保发酵液无杂菌污染；掌握pH调节剂、消泡剂及补料的连接方法；学会从反应器中定时取出样液的方法；学会如何进行参数控制并掌握正确使用先进反应器发酵生产的方法，从而可对中试级中试以上的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识。 实验原理 1.安装和拆卸 反应器为碟形，上盖可以自动起降，与罐体通过橡皮垫圈和螺栓密封。盖上设有搅拌电机、搅拌轴、机械密封及多个接口（接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和酸碱液注入口、补料口、备用口、压力表等）；罐体设有夹套层，用以加热或冷却；罐内有搅拌桨叶、挡板、空气分布器；中部侧面装有温度传感器、溶氧电极和pH电极插口及取样口；与罐体连接的部分布有无菌空气系统，并配备一台自动调控装置。整个装置处于工作状态时，必须保持无菌，而操作结束后，必须移走培养液并清洗罐体等。 2.pH电极的校正 待校正的pH电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电极。复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通，内充以恒定pH的标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极）。在外层玻璃管引入银丝，其表面覆盖一层氯化银薄膜。从上部扩大部分边上的注液口加入饱和氯化钾溶液，即形成氯化银电极，在外玻璃管的下部开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使氯化钾溶液可稍往外溶液渗漏，即所谓的液络部。复合电极的基本性能参数有电极转换系数（也称Nernst斜率）、电极零电位、电极内阻、参比电阻、电极响应时间、耐高温冲击的次数等，它们都有一定的要求和测试方法。新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数会发生变化，对某些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。 溶氧电极的校正 电解型电极是由一个阴极（贵重金属如铂或金）、一个阳极（Ag/AgCl）和一种电解质（如中性NaCl溶液）组成的（图1）。在某一荣溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间0.6~0.8V的电压，使溶解氧在阴极上被还原，从电极的电流—电压极谱图（图2a）中可以看出，OA为极谱残余电流；A点为氧的分解电压，当外加电压大于分解电压A时，电极输出电流I随着外加电压而增加，当达到B点后，电极电流就不再随着外加电压增大而增加，即电极电压进入恒定区，此时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至C点时，电极输出电流迅速增加，这是由水被还原成氧造成的。从图2b中也可以看出，饱和电流与溶氧浓度呈正比关系。因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦部分，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选为0.6~0.8V。 反应式为： 阴极：O2+2H20+2e-→H2O+2OH- H2O2+2e-→2OH- 阳极：Ag+Cl-→AgCl+e- 总反应：4Ag+O2+2H2O+4Cl-→4AgCl+4OH- 用NaCl或KCl作为电解质，在使用过程中电解质被消耗，必须在一段时间后补充。 反应器培养液的灭菌与接种培养 生物反应器的灭菌时采用夹套层蒸汽预热后直接或间接通入饱和蒸汽灭菌的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至121℃，以达到灭菌的效果。灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。 补料、取样 生物反应器的补料（酸碱、消泡剂及其他营养液）可通过蠕动泵进行，可自动也可手动；取样时了解发酵过程的重要手段，取样时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。 实验步骤 准备工作 首先拧下螺栓，启动自动升降机，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。插入校正完毕的pH电极和氧电极与罐侧面相关位置，并与控制连接。加入配置好的培养液，加盖并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管及空气过滤器等，剩余的孔洞需用硅胶塞拧紧备用。使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。 pH校正 此步骤必须于发酵罐灭菌前先校正，再将电极插入罐内。 将电极置入零点标准液里（7.00），看pH稳定后按7.00（ZERO下方）。此时pH显示值（PV）会显示7.00 将电极用纯水洗涤，置入标准液里（4.00），看pH稳定后按4.00键（SPAN下方）。此时pH显示值（PV）会显示4.00 将电极置入标准液里（7.00），看pH之量