香港海鸥形菌检验与实验程序.pptVIP

香港海鸥形菌(Laribacter hongkongersis)检验技术与实验程序 采样材料 剪刀、酒精棉球、酒精灯； 无菌棉签、试管、试管架； 表格、签字笔、记号笔； 白大衣、乳胶手套、围裙； 污物袋、毛巾、肥皂等 实验材料（1） 制备SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂（MA）以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂（CMA）等六种培养基，但我们对CMA中的头孢哌酮（Cefoperazone）浓度略做调整，其含量为16 mg/L或24 mg/L 。 Cary-Blair运送培养基（72h） 实验材料（1） SS、XLD、TCBS、MA及CMA培养皿置37℃，48h； CCDA培养皿置5% CO2环境培养，42℃，48h。 注意事项：新鲜配制 保持湿度 头孢哌酮 各类标本采样 人体标本，肠道门诊患者采样, C-B运送 鱼类标本，现场解剖，采用无菌棉签采集鱼体中、后肠内粪便，插入C-B运送培养基带回实验室，划线接种于MA、CMA 两种培养皿。 鸟类标本，栖息地灌木丛、树叶上新鲜粪便；幼鸟肛拭采样; C-B运送 生理生化试验 革兰染色 MA、CMA培养基上分离到的无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行氧化酶、触酶、三糖铁反应试验。 氧化酶、触酶试验同时阳性，且三糖反应阴性的可疑细菌接种于API20NE、ID32E生化条，做进一步的生化试验 基因诊断 特异性PCR的引物设计，根据我们首次分离到的香港海鸥形菌杭州株（杭州株：LHHZ242；Genbank 登录号：DQ396525）的16S rRNA序列设计引物： P2F：5’TTGAGGGTGCCCGAAAGGGA3’ P2B：5’CTACCCACTTCTGGCGGATT3’ 基因诊断步骤 PCR模板DNA的制备,用接种环挑取经生化试验检测为可疑菌落若干，于500μl无菌蒸馏水中，振荡混匀，7000/rpm离心5min，去上清；加入500μl无菌蒸馏水，水浴煮沸10min，7000/rpm离心5min，取上清液作为模板。以LH杭州株LHHZ242模板DNA为阳性模板对照，并以蒸馏水为阴性模板对照。 基因诊断步骤 反应体系（50μl）：10×PCR缓冲液5μl，25mmol/L MgCl2 4μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，5U/μl的 Taq DNA聚合酶0.25μl，0.6 mmol/L 的引物各1μl，模板DNA 5μl，双蒸水 29.75μl。 基因诊断步骤 反应程序：94℃ 5min；94℃ 0.5min，55℃ 0.5min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min。 16S rRNA基因测序 16S rRNA基因测序：从特异引物PCR阳性菌株中，随机抽样，进行16S rRNA基因PCR扩增, 方法参照文献。PCR扩增产物由上海Sangon公司进行序列测定。 16S rRNA 引物： PLW264：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ LPW265：5’-GNTACCTTGTTACGACTT-3’ 形态学检查 透射电镜（TEM）观察，取LH人体株LHHZ242与草鱼株LHHZ27，经无菌蒸馏水洗脱，2%PTA染色2min～5min，在TEM下观察其菌体大小及形态特征。 实验程序 无菌采样,C-B运送 CMA、MA上典型菌落 革兰染色（阴性） 氧化酶、触酶（同时阳性） 三糖铁（阴性） PCR 16S rRNA 结果讨论 经48h培养后，菌落在CMA培养基上呈无色、透明、扁平状，边缘光滑整齐，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落；在MA上可见少量的上述可疑菌落混杂在众多的粉红色菌落之中。菌落挑取时与琼脂面无粘连。 结果讨论 从人体、鱼类分离到的LH菌株，氧化酶、触酶试验为阳性与三糖铁试验阴性。采用ID32E、API20NE试剂条进行检测，其生理生化试验结果除CAP（Yuan等报道为阳性，本文结果为阴性。）外，均与香港株HKU1相符合 结果讨论 氧化酶、触酶与三糖铁3项生化试验均符合筛选标准的标本，共计21株，其中人体株4株，鱼类株17株，经特异引物PCR检测，结果均阳性。 结果讨论 从中选择8株（人体2株，鱼类6株）进行16S rRNA基因序列分析，经BLAST比对显示，与Yuen等报道[1]LH香港株HKU1（登录号：AF389085）相应序列的相似度达99%～100%（人体株GenBank登录号：EF032599、EF032594；鱼类株GenBank登录号：EF032595~ EF032598、