家禽流行性感冒核酸疫苗制备亚型特异性抗体之研发-家畜卫生试验所.PDFVIP

57 家禽流行性感冒核酸疫苗製備亞型特異性抗體之研發 李敏旭* 、陳麗璇、劉玉彬、鄭明珠、李淑慧 行政院農業委員會家畜衛生試驗所 摘要 將家禽流行性感冒病毒H5 基因之HA1 片段以RT-PCR 增幅出來後，將此 基因轉殖到pCI-neo 及pCDNA3.1 載體，篩選好之真核表現載體配合微脂體以 肌肉注射 100 μg 接種在6 週齡BALB/c 小鼠 及3 週齡無特異病原小雞，之後 每月補強接種共二次，經三次免疫後測試其抗體反應，結果顯示血球凝集抑制 抗體反應均不佳。 關鍵字：家禽流行性感冒，DNA 疫苗，特異性抗體 緒言 之原理。而目前所使用來製造參考血清之方法通常以 活毒或不活化病毒注射雞隻以誘發抗體產生[7]，但 家禽流行性感冒(avian influenza; AI)是由正黏液 這種方式所產生之抗體非只針對血球凝集素而是對 病毒科(Orthomyxoviridae)之 A 型流行性感冒病毒 全病毒所轉譯出的十個蛋白均有抗體反應，若使用在 (type A influenza virus) 所引起之呼吸道疾病，依據 血球凝集抑制試驗會對於結果產生干擾現象[4]，在 血球凝集素及神經氨酸酶二個表面蛋白可區分 16 血清亞型的區分上則造成混淆。基於對本地產業之永 種 HA 亞型及 9 種 NA 亞型。所有 16 種 HA 亞型病 續經營及公共衛生上對人類所造成之威脅性，建立標 毒均可在水禽類發現，為此病毒之儲主[2] 。 自 準抗血清是診斷實驗室必備之材料[6]，故在本試驗 1878 年 Perroncito 首先描述此病後，全球各地陸 中我們嘗試以 DNA 疫苗方式接種試驗動物來製備參 續發生許多的疫情，其間更有多次高死亡率之大爆 考抗血清[8]，希望利用此方法製備單一蛋白之抗血 發，造成嚴重的經濟損失；而在台灣，雖然於 1972 清以減少多源抗體產生之困擾。 年曾發生鴨子之病例，但經謝等於 1988~1991 年 對於台灣飼養之家禽進行抗體調查及病毒分離的結 材料與方法 果，證實在家禽普遍有家禽流行性感冒之抗體存在， 並且可分離到許多亞型之病毒株。由於水禽為家禽流 病毒株與 RNA 萃取：以 2003年由台灣雞場所分 行性感冒病毒主要之保毒者，而候鳥每年的遷移會將 離之家禽流行性感冒病毒株（A/CK/TW/1209/03 病毒帶入台灣，因此，在國外陸續發現禽源之 H5N1 （H5N2），取200μL 的病毒液檢體置入樣本微量 及 H9N2 流行性感冒病毒感染人類之事件後，更凸 管 ，加入 1 毫升Trizol®試劑 （Invitrogen）均勻混 顯出家禽流行性感冒防疫檢疫工作的重要性。家禽流 合後靜置5 分鐘，加入 0.2 毫升phenol / chloroform 行性感冒病毒 HA 亞型的區別是利用參考血清進行血 / isoamylalcohol （25 ：24：1），混合均勻後以 球凝集抑制試驗（hemagglutination –inhibition test） 12,000 rpm 離心 15 分鐘，取上清液至另一新管 ， 當作標準方法[8]，藉由亞型特異性抗體抑制病毒封 加入等量之 isopropanol 待混合均勻後以 12,000 套上之血球凝集素與紅血球表面接受器的交互作用 rpm 離心 20 分鐘 ，倒去上清液加入 70﹪酒精以 58 1,2000 rpm 離心 5 分鐘 ，去除液體後風乾或烘乾 ， 後，利用血球凝集抑制試驗測定抗體力價