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超声波破碎细胞的常见问题 大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100 的PBS 悬浮，然后超声的 效果较好，1%triton-X-100 的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。 细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul 的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染 色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热 1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换 成大量的水( 自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。 在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w ，破2s 停1s，但是不一会就产生大量泡 沫，影响了破碎功率，pbs 和tris 缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在 这些未破碎的细胞中。 1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约 1cm （我一般是距底部 0.5mm ）。功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。 2*破3S 停10S，破个二三十次看看。 3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。 在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%. 4*尝试超8s 停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿 时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。 问：链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？ 答：前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。 使用超声破碎时采用的具体条件是： (1)取细菌的24 h 培养液于5 000 r ／min 下离心5 min 收集菌体． (2)用pH 7 ．5 的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3 次，再用该缓冲液将菌体配成1：3 的菌悬液．置 于40 mL 大塑料试管内． (3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W ，1 ／2”探头，破碎30 s，间歇30 S) ． (4)破碎液于12 000 r ／min 下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜． 超声破菌流程与 上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8 的Tris －HCl， 洗涤一次就可以。另外，超声剂量随样品量、菌体改变比较大，功率可以到400 －600w，超5s， 停5s，冰浴，要加终浓度1 mM 的PMSF 。为确定合适的超声强度和次数，有必要随时镜检观察 菌体是否完全破碎。 放线菌属于原核生物系统进化树上的（G ＋C ）摩尔百分含量（mol ％）高的革兰氏阳性菌 （Eubacteria ）分枝类群，它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性，但在其不同类群中，细 胞壁的化学组分变化很大。 在做大肠杆菌超声时，采用的是400W ，超5 停5 的方法，效果不错，但是用在链霉菌上，似 乎没什么效果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢，因为大肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。 问：再有镜检是检验破碎效果,但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗？破碎时 间长也会影响到酶的活性。所以想问问anaisai 战友，你提供的“功率200 W ，1 ／2”探头，破碎 30 s，间歇30 S”的条件好像是用于破碎链霉菌孢子的，也可以用于发酵离心后的菌泥吗？如果 可以，你破碎的全程时间大概是多少呢？ 答：如果你需要的是胞内酶，细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。破碎时间长 的确会影响到酶的活性。这就需要在最佳的破碎时间和酶活性之间做出判断，最直接的办法是先 绘制相关曲线（酶活性和时间的关系曲线）。 实验中，破碎的是棒状杆菌（也是很难破壁的G+菌），破碎时间控制在30min 左右，酶活较 好。 如果是基质菌丝的话,好可以考虑用溶菌酶处理一下. 一般来讲这几种方法读可以的: 一,液氮研磨 二,用french press 破碎 三，超声波破碎 四，溶菌酶处理预处理 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它既是一种波动形式,又是一种能量形式。超声对细 胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了 由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42 －43 ℃）。空化效应是在超声照射下， 生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外，空化泡 破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达500×104Pa ），可使水蒸气热解离产生.OH 自由 基和.H 原子，由.OH 自由基和.H 原子引起的氧