形成双链DNA分子.ppt

§1-2 基因工程的基本操作程序 南昌市第二中学 付晓华 §1-2 基因工程的基本操作程序 南昌市第二中学 付晓华 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定： 寻根问底 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 位于基因的末端,终止转录 检测目的基因是否导入受体细胞 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 注意 3、将目的基因导入受体细胞 转化 —— 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 3、将目的基因导入受体细胞 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 特点: 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 （3）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射法 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 所以要对受体细胞作怎样的处理？ 对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 怎样进行检测？ 4、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 检测— 鉴定—— ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法—— 方法—— 方法—— DNA分子杂交 分子杂交 抗原抗体杂交 Go on 知识延伸——DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。 DNA 附着在膜上 硝化纤维素 加探针 报告基因（含荧光素分子） 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等