血清中提取IgM方法和蛋白连接方法.docVIP

血清中提取IgM方法和蛋白连接方法 血清中提取IgM方法 SDS: 12% Tris HCl gel Lane 1. 5 μg IgM (reduced/heated) Lane 2. 10 μg IgM (reduced/heated) Lane 2. 20 μg IgM (reduced/heated) Lane 3. 5 μg IgM (non-reduced/no heat) Lane 4. 10 μg IgM (non-reduced/no heat) Lane 5. 20 μg IgM (non-reduced/no heat) 人IgM的基本性质 总分子量970kDa，重链μ链分子量68kDa，沉降系数19S，pI=5.1-7.8，结构域5个，血液含量1.5mg/ml，半衰期10天，血清中总球蛋白比重10%，碳水化合物12%。 盐析法 盐析法 （1）饱和硫酸铵溶液的配制：称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N　NH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。 （2）萘氏试剂配制：称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。 （3）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制：贮存液 A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液： 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。 （4）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制：将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。 （5）20%磺基水杨酸。 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50% 4℃，3h以上，使其充分沉淀3000rpm离心20min，弃上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]。重复上述过程1~2次。末次离心所得沉淀物为 影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。 影响盐析的因素：影响盐析的因素很多，如 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。 （1） HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的浓度 盐析时，溶液中 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质沉淀极限，又可影响 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的共沉作用。 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。 （2）离子强度 各种 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白及大多数拟球 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白析出；饱和度为33％时γ球 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白析出。 （3）盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。 （4）PH值：一般说来， HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的带电性质，也就改变了 HYPERLINK /html/protein/index.html 蛋白质的溶解度。 （5）温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清 HYPERLINK /htm