hsa-mir-520真核表达载体的构建及对E-钙粘蛋白表达的影响.docVIP

hsa-mir-520真核表达载体的构建及对E-钙粘蛋白表达的影响 张潞渝作者介绍：张潞渝，男，实验师 研究方向：分子医学与肿瘤通讯作者：武卫华，E-mail: 叶彬，电话：02368485898 孔璟2 高剑2 叶彬1,2 作者介绍：张潞渝，男，实验师 研究方向：分子医学与肿瘤 通讯作者：武卫华，E-mail: 叶彬，电话：02368485898 （1.重庆医科大学分子医学与肿瘤中心，重庆 400016; 2.重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室，重庆 400016） 摘要: 目的 构建hsa-mir-520真核表达载体，并转染大肠癌细胞SW-480细胞，检测细胞中E-钙粘蛋白表达情况。方法 依据miRBase数据库中hsa-mir-520序列，设计并合成寡核苷酸片段，构建hsa-mir-520表达载体和对照载体。采用脂质体转染方法分别将mir-520表达载体、及对照质粒转染大肠癌细胞SW-480细胞株。采用酶切、测序检测载体构建；Weshern Blot检测E-钙粘蛋白的表达。结果 酶切和测序表明hsa-mir-520真核表达载体构建成功。Weshern Blot结果显示与转染对照质粒和未转染的细胞相比，转染了hsa-mir-520重组质粒的细胞中E-cadherin蛋白的表达明显增加（P0.01），密度扫描半定量分析显示E-cadherin蛋白的表达增加了大约40%。结论 成功构建了hsa-mir-520和对照的真核表达载体，hsa-mir-520质粒转染大肠癌细胞SW-480后可增加E-钙粘蛋白的表达。 关键词：hsa-mir-520；E-钙粘蛋白 中图分类号：R73-3；Q78 Construction of mir-520 expression plasmid and its effect on the expression of E-cadherin gene Zhang Luyu, Kong Jing, Gao Jian, Ye Bin Wu Weihua, Liu Geli （1. Chongqing Medical University Chongqing 400016 2．Department of Pathogen Biology, Chongqing Medical University Chongqing 400016） 微RNA（microRNA，miRNA）广泛存在于真核生物中，是一类由基因组编码的非编码RNA。MicroRNAs在细胞的多个过程如发育、增殖和凋亡中发挥着重要作用。microRNA可通过与靶mRNA的3′非翻译区3′UTR）序列不完全配对的方式对相应的蛋白编码基因进行转录后水平调控[[] Standart N, Jackson RJ. MicroRNAs repress translation of m7Gppp-capped target mRNAs in vitro by inhibiting initiation and promoting deadenylation [J]. Genes Dev,2007,21(16):1975-1982.]。一般认为miRNAs通过沉默靶基因的表达来发挥作用[[] He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation [J]. Nat. Rev. Genet, 2007,5(7): 522–531]。有研究发现人工合成的dsRNAs和相应基因启动子区的结合可诱导基因表达，并将此现象称为RNA激活(RNAa)。RNAa诱导了表现型的改变，靶基因的受到诱导而影响了下游基因的表达[[] Li LC, Okino ST, Zhao H, et al. Small double-stranded RNAs induce transcriptional activation in human cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(46):17337-17342.,[] Janowski BA, Younger ST, Hardy DB, et al. Activating gene expression in mammalian cells with promoter-targeted duplex RNAs. Nat Chem Biol, 2007,3(3):166–173..]。如同RNAi, RNAa可操控基因的表达而改变细胞路径和改变细胞生理。然而，同RNAa类似，miRNAs也可能正向调控基因表达。E-钙粘蛋白(