海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证-作物遗传育种专业论文.docxVIP

I I 海岛棉枯萎病抗性相关基因的克隆及功能验证 摘 要 新疆是中国唯一的海岛棉种植基地。海岛棉比起陆地棉有着纤维长度、比强 度、细度等方面优异的特性，是纺高支纱必不可缺少的原料，在国民经济中具有 举足轻重的地位。然而海岛棉枯萎病的蔓延严重制约着其生产，影响了棉农种植 海岛棉的积极性，使新疆海岛棉种植面积及产量都大幅度下降。棉花抗病新品种 的选育和种植是解决这个难题的有效途径之一。培育抗病棉花新品种的关键是要 研究海岛棉抗枯萎病的机理机抗病相关基因的作用，从而在分子水平上对海岛棉 加以改良，获得具有高抗特性的棉花新品种。 本研究首先以定位到的与海岛棉枯萎病抗性基因紧密连锁的分子标记为基 础，通过对功能标记位点的克隆，获得抗性相关基因的全序列；利用 RT-PCR 研 究该基因的表达特性，并通过转化烟草进一步揭示该基因在枯萎病抗性中的作 用，结果如下： 1.根据 GenBank 数据库上公布的抗病基因序列，设计出 107 对 RGA 引物， 利用高抗枯萎病的海岛棉品系“06-146”、高感枯萎病的海岛棉品种新海 14 号及 以杂交 F2 群体中随机选取的 180 个单株为实验材料，利用 RGA 引物在亲本间筛 选出来的 12 对引物在抗、感基因池中进行筛选，初步确定 Gbrga14 是与海岛棉 枯萎病 紧密 连锁的 分 子标记 ，该 分子标 记 与海岛 棉枯 萎病抗 性 的交换 值为 15.5%，与海岛棉抗枯萎病基因的遗传距离为 15.92 cM。查找连锁标记的来源发 现，根据拟南芥 RPP5 基因设计的引物最多，有 4 对（占 33.33 %）。这 12 对具 有多态性的 RGA 标记主要由 3 类组成，其中 TIR-NBS-LRR 类 6 对，占 50%； NBS-LRR 类 5 对，占 41.67%； NBS 类 1 对，占 8.33%。 2.通过对 Gbrga14 在两亲本间扩增出来的位点进行回收测序，以该测序片段 为探针，通过同源克隆的方法，分别克隆到两条抗性相关基因，命名为 RGBCH 和 SGBCH。BLAST 比对分析显示，RGBCH、SGBCH 基因具有较高的基因多态 性。生物信息学分析表明，α-螺旋均是两个蛋白二级结构的主要部分。ProtFun II II 预测 RGBCH 蛋白的主要功能是参与能量代谢和生物合成辅助因子；SGBCH 蛋 白的主要功能是参与蛋白质翻译过程中的能量转换。 3.选取 5 份不同的海岛棉及陆地棉材料，经枯萎病诱导后，取不同的组织器 官分别进行荧光定量 PCR 检测。利用特异性引物 GBCH–Q 对材料的荧光定量 PCR 分析可知：品系“06-146”目的基因在不同组织器官的表达量在 4d 达到峰 值；新海 14 号目的基因在 6d 时出现一个最高值，随后降低到最初水平；中棉所 35 号、军棉 1 号和 TM-1 在诱导前和诱导后表达量均很微弱或者比较一致，基本 维持在低水平表达；利用引物 StVe-Q 对材料的荧光定量 PCR 分析可知：品系 “06-146”、新海 14 号、中棉所 35 号、军棉 1 号和 TM-1 的目的基因在病菌诱 导条件 下， 没有随 着 诱导时 间的 变化而 呈 现表达 变化 状态。 说 明已克 隆的 RGBCH 和 SGBCH 只在海岛棉材料中表达，是与枯萎病抗性相关的两个基因。 4.将 RGBCH、SGBCH 基因重组到 pCAMBIA1301 植物表达载体上，构建了 海岛棉 pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH 的植物表达载体，同时 利用农杆菌介导的方法将 RGBCH、SGBCH 基因整合到烟草基因组中，并获得 T1 代种子。对 T1 代转基因及非转基因烟草采用菌液浇根法（每种材料种植 30 株）， 转 RGBCH 基因植株的存活率为 78%，叶片呈显黄化状态，，而转 SGBCH 基因 大部分的叶片干枯直至死亡，植株的存活率为 24%，非转基因植株几乎全部死亡。 研究表明转 RGBCH 基因的转入提高了烟草的抗枯萎病病菌的能力。 关键词：海岛棉；Fusarinm wilt；连锁标记；荧光定量 PCR；功能验证 PAGE PAGE VI Fusarium Wilt resistance related-gene cloning and functional analysis of Gossypium barbadense L. Abstract Cotton is the main cash crops,which has a pivotal position in the national economy.Xinjiang cotton district,as the main raw cotton produ