实验7核来酸的提取.pptVIP

实验七 动物组织核酸提取与鉴定 一、实验原理 核酸是生物体最重要的组成成分之一。动物组织细胞中的核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（ DNA）大部分与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。因此分离核酸时必须使核酸与蛋白质分离，并除去蛋白质。 本实验是将组织匀浆后加水饱和酚溶液，振荡使蛋白质变性，变性蛋白质溶于酚相或两界面处形成凝胶层。而DNA或RNA则溶于上层的水盐溶液中。在离心后上层的水盐溶液中加入乙醇，核酸不溶于乙醇而形成白色絮状沉淀析出。 DNA与 RNA均由单核苷酸组成，每个单核苷酸中含有磷酸、嘌呤与嘧啶、戊糖（核糖、脱氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三种物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质。 （1）磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨基萘酚磺酸还原成蓝色钼蓝 （2）嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化合物。 （3）戊糖: A.核糖:用硫酸使之生成糠醛，糠醛与3，5－二羟甲苯综合成为一种绿色化合物 B.脱氧核糖：在硫酸作用下，与二苯胺生成蓝色化合物 二、试剂及器材 钼酸铵试剂 氨基萘酚磺酸 3，5－二羟甲苯溶液 二苯胺试剂 0.9%NaCl 20％三氯醋酸 水饱和酚 预冷的95％乙醇 浓硫酸 5%硝酸银 5%硫酸 实验步骤一：动物组织中核酸的提取 1. 匀浆制备：全班制备一份。取冻存兔肝20g置匀浆器中，加入0.9%NaCl溶液60ml制成匀浆。 2. 提取：将匀浆取出分装在四个100ml塑料离心管内，分别加入1mol/L NaCl溶液15ml，混匀，再加入水饱和酚溶液40ml，剧烈振荡10min，然后4000rpm离心20min。 将上清轻轻吸入一烧杯中，每2人一组取上清液4ml于小离心管中，加入等量的预冷的95%乙醇，即可见白色沉淀逐渐析出，静置10min后，3500rpm离心10min，倾去上清，即得白色的核酸钠沉淀。 实验步骤二、核酸的水解 在含有核酸钠盐的离心管内加入5%硫酸4ml，用玻璃棒混匀，转入小试管中，在沸水浴中加热15min。 实验步骤三、DNA与RNA成分鉴定 （1）嘌呤碱的鉴定： （2）磷酸的鉴定 （3）核糖的鉴定： （4）脱氧核糖的鉴定 Company Logo Company LOGO 10滴 10滴 数滴呈碱性 数滴呈碱性 —— 20滴 20滴 —— 1 2 5%硝酸银 浓氨水 5%硫酸 水解液 试管号 加入硝酸银后，观察有什么变化？静止15min后再比较两管中沉淀颜色有何变化？ 20滴 20滴 5滴 5滴 —— 10滴 10滴 —— 1 2 氨基萘酚磺酸 钼酸铵试剂 5%硫酸 水解液 管号 沸水浴中加热数分钟，观察两管颜色变化。 6滴 6滴 —— 4滴 4滴 —— 1 2 3，5－二羟甲苯溶液 5%硫酸 水解液 管号 沸水浴中加热10min，比较两管颜色变化。 30滴 30滴 —— 20滴 20滴 —— 1 2 二苯胺试剂 5%硫酸 水解液 管号 沸水浴中20min观察颜色变化