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* 细胞迁移和检测技术 细胞培养讲座-2 恶性肿瘤基本特征 定义 肿瘤侵袭（Invasion) 是指恶性肿瘤细胞离开原发灶而侵犯邻近组织并继续增殖的过程。 ◆肿瘤细胞的增殖 ◆肿瘤从原发灶脱离—E-钙粘连素下降 ◆肿瘤细胞的运动性和趋化性 ◆血管生成与肿瘤侵袭 侵袭包括四个过程 是恶性肿瘤细胞脱离原发部位，通过各种渠道转运到不连续的靶组织中继续增殖，形成同样性质肿瘤的过程。 远隔部位继发瘤形成 继发瘤继续生长 继发瘤再侵袭转移 肿瘤转移(Metastasis) 脱落 血道、淋巴道转运 着床 转移灶新生血管形成 人类对肿瘤侵袭转移的认识 肿瘤是高度异质性的细胞群体 转移是一个多步骤、序贯的复杂过程 转移的发生是多因素相互作用的结果 （Fidler,IJ Surgical Oncology Clinics of North America. 2001，10（2）：257-269） 肿瘤转移特点 1. 不同肿瘤其转移能力有差异 低转移 基底细胞癌、脊髓瘤、 唾液腺腺样囊性癌、软骨肉瘤、 高转移 甲状腺滤泡型腺癌、黑色素瘤 2. 不同类型肿瘤其转移途径不同 淋巴道转移 癌 如肺癌、 NPC 血道转移 肉瘤、绒癌、肾癌 前列腺癌等 3. 转移的器官特异性 原发瘤 转移器官 乳腺癌 骨、脑、肾上腺 前列腺癌 骨 肺小细胞癌 骨、脑、肝 甲状腺癌 骨 肾癌 骨、肝、甲状腺 膀胱癌 脑 睾丸癌 肝 … … 细胞迁移检测技术 1. Transwell A. 有基质胶Transwell小室-检测细胞侵袭 无基质胶Transwell小室-检测细胞迁移 2. 划痕实验 3. 体内实验 Transwell 小室 1. Transwell小室制备 A. 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/L Matrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。② 水化基底膜： 从4 ℃ 取出，37 ℃ 复温，每孔加入300ul含无血清培养液，37℃，2h。 B. 有基质胶的Transwell小室制备BD公司的系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，37 ℃2h使基质胶水化。再吸去剩余培养液。 2．制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－5×105，不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 3. 接种细胞① 取细胞悬液100－200μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200μl。② 24孔板下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱. ③ 培养细胞：常规培养24h以内（主要依癌细胞侵袭能力及细胞倍增时间） 4 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法： A 直接计数法 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如图： ① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 ② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏