SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详细讲解.pptVIP

Molecular mass versus molecular weight Molecular mass (symbol m) is expressed in Daltons (Da). One Dalton is defined as 1/12 the mass of carbon 12. Most macromolecules are large enough to use the kiloDalton (kDa) to describe molecular mass. Molecular weight is not the same as molecular mass. It is also known as relative molecular mass (symbol Mr, where r is a subscript). Molecular weight is defined as the ratio of the mass of a macromolecule to 1/12 the mass of a carbon 12 atom. It is a dimensionless quantity. When the literature gives a mass in Da or kDa it refers to molecular mass. It is incorrect to express molecular weight (relative molecular mass) in Daltons. Nevertheless you will find the term molecular weight used with Daltons or kiloDaltons in some literature, often using the abbreviation MW for molecular weight. 谢谢指导！ 汇报完毕 2、操作（1） 制备分离胶（2） 制备积层胶(堆积胶） 分离胶聚合之后 （3） 加样品样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形 ①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。 ②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。 ③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。 （4） 电泳 （5） 固定 （6） 染色考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue）①R-250  三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。 ②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。 银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。 （7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定 3、电泳过程中的不正常现象（1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。 （2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。 （3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。 （4）“纹理”现象由于样品中的不溶颗粒引起的。 （5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起 （6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS一、什么是SDS？ 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。 SDS的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 二、SDS的基本原理 （一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。 1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试