重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与免疫保护力评价.pdfVIP

中国兽药杂志２０１８年９月第５２卷第９期　 　 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ ·１· － ｄｏｉ：１０．１１７５１／ ＩＳＳＮ．１００２ １２８０．２０１８．０９．０１ 重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的 表达与免疫保护力评价 杜吉革，朱 真，薛 麒，赵俊杰，彭小兵，张秀坤， 李启红，印春生，姚文生，康 凯，陈小云∗ （中国兽医药品监察所，北京 １０００８１） － － － － － ［收稿日期］２０１８ ０１ ２５　 ［文献标识码］Ａ　 ［文章编号］１００２ １２８０ （２０１８）０９ ０００１ ０８　 ［中图分类号］Ｓ８５２．６１ ［摘　 要］　 为获得产气荚膜梭菌α毒素（ＣＰＡ）的重组突变体，并评价其毒力和免疫原性，对已知的 产气荚膜梭菌ＣＰＡ编码基因进行优化设计，同时引入包括第５６位和第１３０ 位的天冬氨酸（Ｄ）突变 为甘氨酸（Ｇ），及第２７５位的酪氨酸（Ｙ）和第３３６位的天冬氨酸（Ｄ）突变为天冬酰胺（Ｎ）的４ 个氨 基酸突变。 此外，在该基因５＇端添加Ｔｈ 细胞表位（Ｔ）和鞭毛蛋白（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）Ｎ 末端编码序列，经人 － ＋ 工合成获得基因片段ＧＴＦ ＣＰＡ 。 将ＧＴＦ ＣＰＡ 克隆至原核表达载体ｐＥＴ ３０ａ （ ）中进行表达与 Ｎ ｍ４ Ｎ ｍ４ 纯化，获得重组蛋白ｒＴＦ ＣＰＡ 。 利用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 方法检测ｒＴＦ ＣＰＡ 与产气荚膜梭菌Ａ 型毒素 Ｎ ｍ４ Ｎ ｍ４ 抗血清的反应性，并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。 随后，将重组蛋白与 Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０１佐剂以１ ∶ １（Ｖ／ Ｖ）的比例混合乳化，免疫家兔，检测兔血清的中和抗体效价。 二免后２１ｄ，对家兔通过耳缘静脉注射１个ＭＬＤ剂量的Ａ 型产气荚膜梭菌毒素，以检测ｒＴＦ ＣＰＡ Ｎ ｍ４ 对家兔的免疫保护效果。 结果表明，ｒＴＦ ＣＰＡ 主要以包涵体的形式表达，且能与Ａ 型产气荚膜梭 Ｎ ｍ４ 菌毒素产生血清反应；体外实验显示，ｒＴＦ ＣＰＡ 无卵磷脂酶和溶血活性；小鼠安全性实验显示， Ｎ ｍ４ ５．５ ｍｇ／ ｋｇ 剂量的ｒＴＦ ＣＰＡ 对小鼠无致死性；免疫重组蛋白后，每毫升的一免抗血清可中和 Ｎ ｍ４ １０个ＭＬＤ、二免抗血清可中和４０个ＭＬＤ 的Ａ 型产气荚膜梭菌毒素；１个ＭＬＤ 的Ａ 型产气荚膜梭 菌毒素攻毒后，对照组家兔４／ ４ 死亡，免疫组家兔得到了１００％（４／ ４）的保护。 以上数据说明，表达 的ＣＰＡ 重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性，为Ａ 型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗 的研制提供了重要的实验数据。 ［关键词］　 Ａ 型产气荚膜梭菌ＣＰＡ；突变；Ｔｈ 细胞表位；鞭毛蛋白；重组表达；毒力；抗原性 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ αＴｏｘｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ － － － －