- 1、本文档共3页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素目的掌握凝胶层析的基本原理熟悉凝胶层析的操作过程原理凝胶层析又叫分子筛层析是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法当分子大小不同的物质通过凝胶时由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用本实验用葡聚糖凝胶作支持物用核黄素黄色相对分子质量为和血红蛋白红色相对分子质量为混合物作样品在层析时血红蛋白相对分子质量大不能进入凝胶颗粒内部而从凝胶颗粒间隙流下所受阻力小移动速度快先流出层析柱核黄素相对分子质量小可进入凝胶颗粒内部洗
实验二十三 凝胶层析分离血红蛋白和核黄素
【目的】
1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2.熟悉凝胶层析的操作过程。
【原理】
凝胶层析又叫分子筛层析,是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物,用核黄素(黄色,相对分子质量为267)和血红蛋白(红色,相对分子质量为67000)混合物作样品,在层析时,血红蛋白相对分子质量大,不能进入凝胶颗粒内部,而从凝胶颗粒间隙流下,所受阻力小,移动速度快,先流出层析柱;核黄素相对分子质量小,可进入凝胶颗粒内部,洗脱流程长,因而所受阻力大,移动速度慢,后流出层析柱。这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。收集洗脱液后,在分光光度计上测定两种组分的吸光度,绘制洗脱曲线。
【器材】
分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶 、刻度吸管 、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸 、铅笔 、玻璃棉或海绵垫。
【试剂】
1.葡聚糖凝胶SephadexG-25 或SephadexG-50
2.核黄素饱和水溶液
3.生理盐水
4.甲苯
5.血红蛋白溶液
取抗凝血2ml置离心管中,2000r/min离心10min,使血细胞沉淀,弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4ml,振摇洗涤,2000r/min离心10min,弃去上清液,共洗涤三次。向沉淀加入蒸馏水2ml,混匀,再加入甲苯1 ml,猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。2000r/min离心10min,取上清血红蛋白溶液备用。
6.0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)
取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml和0.1mol/L磷酸二氢钠280ml,混匀。
【操作】
1.凝胶准备
称取SephadexG-25 5g或SephadexG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml,置于水中浸泡6小时(沸水浴中溶胀2小时),用磷酸盐缓冲液漂洗,去除漂浮的细小颗粒。
2.装柱
取直径0.8~1.2cm长25~30cm的层析柱一支,将层析柱出口接上乳胶管,在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。关住层析柱出口,用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液,顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm高时,打开出口,使缓冲液缓缓流出,同时继续倒入凝胶悬液,掌握倒入速度,使其与缓冲液流出速度大体相同,直至凝胶床高度达18cm时为止。关闭层析柱出口,要求凝胶床要均匀,中间要连续,不得有气泡或断纹,表面要平整。如凝胶床表面不平整,可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起,待其自然下沉,即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。
3.样品制备
将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比)混匀。
4.加样
打开层析柱出口,使缓冲液缓缓流出,当液面与凝胶床表面平齐时,关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5ml,在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口,使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液,约1cm高。加样不可过多,以免分离不完全。
5.洗脱
将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口,使细玻璃管的下端插入液面,但不可接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置,使其略高于层析柱,将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上,保持密闭状态。打开下口瓶出口,然后打开层析柱出口,使磷酸盐缓冲液缓缓流出,保持4~6滴/min的流速。洗脱速度不可过快,以免区带不清晰。
6.收集
随着层析的进行,凝胶床将出现两条明显的区带,血红蛋白区带在下,核黄素区带在上。当血红蛋白区带即将流出时,开始收集,每管收集约1ml,直到流出液变为无色为止,约需收集5~6管;以同样方法收集核黄素。
7.测定
在540nm波长下,以磷酸盐缓冲液调零,测定血红蛋白和核黄素各管吸光度。
【结果及分析】
以管号为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制洗脱曲线。分析实验结果并说明原因。
【思考题】
1.比较凝胶层析与分配层析在实验原理上的区别。
2.要使凝胶床达到实验要求,需注意哪些操作?
您可能关注的文档
- 北京社科联2012年重大决策咨询课题招标公告-商丘社科联.DOC
- 北京科技大学与瑞典布莱京理工学院-湖南大学信息科学与工程学院.DOC
- 北京科技大学物流工程硕士课程班MLE招生简章.DOC
- 北京第八届商业服务业技能大赛跨境电子商务技能竞赛项目实施.DOC
- 北京第六十五中学2012013学年高二上学期期中达标测试物理.DOC
- 北京联合大学2019年公开招聘医务人员公告.DOC
- 北京航空航天大学在职人员因公出国进修访问-中国石油大学北京.DOC
- 北京航空航天大学沙河校区大学生活动中心梦幻剧院-北航沙河校区.DOC
- 北京航空航天大学计算机学院虚拟手术模拟器采购项目招标公告.DOC
- 北京西南周口店龙骨山顶部洞穴2.PPT
- 分析let s单元56ago2卷纸zheng unit56.pdf
- 塑胶材料其它分类原料pa9t 12.pdf
- md16x16数字媒体切换器设备.pdf
- 者参考项目发起人学科类型单位序列承包商修订页代码顺序典型.pdf
- 届世界天然气大会阿姆斯特丹2006add10288.pdf
- 期测试记录表每周weekly g1g6 journeys tests level 6 lesson26.pdf
- modernize-whitepaper现代化您应用程序白皮书.pdf
- anybackup产品典型案例分析.pdf
- 约克金融工程课程tfeslide32.pdf
- 广州市妇女儿童医疗中心历份教学药历01tjy.pdf
文档评论(0)