BD流式分选的原理和应用.pptxVIP

流式细胞术基本原理及应用 申晓萌Tel:-mail: shenxiaomeng@纲要流式细胞仪的原理流式细胞仪的应用BD FACSJazz个人型流式细胞分选仪Fairlegh S. DickinsonMaxwell W. BectonBD公司简介美国BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。1974年，BD与美国斯坦福大学合作研制出全球第一台商用流式细胞分选仪，不断推陈出新，在流式细胞领域始终保持领先地位。全球500强企业之一市场情况BD是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有率为85%，高端分选型流式细胞仪占有率大于90%。在全国各大医院和科研院所，大部分为BD公司的仪器，总计数量已超过2000台， 如：清华大学，北京大学，中科院系统，军科院系统，医科院系统等等BD公司流式细胞仪InfluxFACSAriaIIFACSJazzLSRFortessaFACSCantoIIAccuri C6Injector TipSheath fluidFluorescencesignalsFocused laserbeam什么是流式细胞仪？在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器；流式细胞仪特点及检测标本特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液检测范围细胞结构组成细胞功能大小细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度细胞活性DNA、RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子、pH值、膜电位酶活性流式细胞仪能告诉我们什么？细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC）细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC）相关的荧光强度前向角散射光信号FSC侧向角散射光信号SSC488nm 520nm异硫氰酸荧光素（FITC）流式细胞仪的检测信号-荧光激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素分子利用激发光提供的能量激发荧光分子的初级电子跃迁到激发态，然后返回基态轨道释放能量（也就是发射光）。流式细胞仪的检测信号-荧光使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量常用的荧光素：PE，FITC，APC等流式对照的设置对照的设置流式细胞术显示的荧光强度是相对的、可调节的，所以需要设置一系列对照来确定细胞是否阳性。阴性对照阳性对照单染对照（补偿对照）对照的设置-阴性对照空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的自发荧光 同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体亚型一致的免疫球蛋白（即Fc段相同，Fab段不同）。用于确认细胞是否为抗原特异性染色，排除非特异染色。对照的设置-阳性对照阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。与阴性对照一起判断测试样品是否为特异性染色。对照的设置-单染对照（补偿对照）补偿对照-多色荧光分析会有光谱交叉，需要荧光补偿几色分析需要设置几个补偿对照单染对照（补偿对照）-荧光补偿方法530/400580/30FITCPE流式细胞仪如何得到细胞分选细胞从复杂的细胞群体中得 到高纯度的靶细胞，进一步深入研究高速分选原理分选时，液流自驱动力的作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下的几毫米处，液滴从液流断开。从颗粒被检测到液滴断开的时间称为液滴延迟时间，由BD专利的Accudrop技术直接计算符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴将要从液流断开时，液流被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液滴通过被充电的偏转板。受静电吸引或排斥，带电液滴将向左或向右偏转。不带电的液滴不偏转而流入废液槽。部分应用实例科学是复杂的，工具是简单的转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选用带GFP (绿色荧光蛋白 ) 标记的质粒转染细胞， 在488nm激光激发下， 表达GFP的细胞发绿色荧光。本实验为U937 细胞转染GFP和目的基因， 用BD FACSAria III 分选高表达GFP目的基因的细胞。本案例用BD FACSAria III 分选GFP阳性细胞， 该样本GFP阳性的目标细胞含量仅为1 .9%， 分选后回测， 目的细胞纯度高达99%。转染绿色荧光蛋白GFP细胞的分选分选后细胞在显微镜白光视野下可