HRM高分辨率熔解曲线分析技术-百替生物.pptVIP

每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 HRM高分辨率熔解曲线分析技术 百替生物--Dendi 2014-07-10 HRM(High Resolution Melting): 于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。 RealTime PCR HRM TM值：当前温度下50%的双链解链为单链 HRM与RealTime PCR的异同点： 需要加入荧光染料 检测获取荧光信号 采用的染料类型不同（Sybr和LC） 荧光信号检测时机不同 分辨率不同 数据处理方式不同 饱和染料有效避免了检测荧光信号中的假阳性 新的饱和染料降低了传统染料对PCR反应的抑制作用 LC GREEN 高分辨率： DNA的熔解曲线取决于DNA碱基序列。理论上任何一个碱基的改变，都会造成TM值的差异，但是单个碱基改变造成的差异是极小的，通常只有零点几度。因此要精确检测TM值的差异，就至少需要保证每0.1℃获取一次荧光信号。 LightScanner HRM原理示意图 HRM的技术优势： 1.整体操作方法简单，检测灵敏度高，可检测出单个碱基的改 变，检测效率高，5-10分钟即可完成对96/384孔板的检测。 2.从PCR到检测荧光信号，整个过程在同一个管中进行，最大 程度的避免了污染。 3.无需事先知道突变位点，无需设计探针，大大简化实验设计 时间和研究成本。 HRM在医学领域中应用： 1)疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突 变的发现2) HRM在序列配对中的应用。 3) HRM在基因分型中的应用。 4) HRM在甲基化分析中的应用。  在胃肠道间质瘤（GIST）中新发现的7个c-kit激活型(c-kit-activating)突变基因位于第11号外显子中，为从基因水平诊断GIST提供了新的方法。(Willmore et al., 2004) Anatomic Pathology 在非小细胞性肺癌（NSCLC）患者中发现第19号外显子中存在有(L747-P753insS)突变，为以后针对性的分子诊断以及设计药物有潜在意义。(Smith et al., 2008) Clinical Pathology HRM在突变扫描中的应用举例 HRM在序列配对中的应用举例 Human Leucocyte Antigen(HLA)人类白细胞抗原： 位于第六号染色体的短臂6P21.31区，长3600KB，根据功能和产物结构的不同分成3组：经典HLA基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因。其中经典HLA基因与输血和移植急性排斥反应密切关联。 在器官移植中，通过检测样本的HLA，以便了解样本组织与宿主是否相容。利用HRM技术，直接观察溶解曲线，可以迅速的找到最匹配的器官组织，为挽救患者的生命争取宝贵的时间。 HRM在基因分型中的应用举例 在拉米夫定抗病毒治疗过程中，病毒合成的DNA聚合酶会在YMDD序列出发生变异。利用HRM和DNA测序法同时检测45例样本，其中HRM检测结果与测序法检测结果几乎一致，符合率为93.3%。因此利用HRM大规模检测YMDD变异是简单有效的方法。（实用医技杂志 2008） HRM在甲基化中的应用 甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰，对调节基因表达，癌症、老年痴呆等许多疾病相关，因此检测甲基化在医学领域中具有重要作用。 利用亚硫酸氢盐将未甲基化的DNA中的胞嘧啶转换成尿嘧啶之后，处理过的DNA产物将比甲基化的DNA产物的TM值要低，通过HRM可以将二者区分开来。 由于HRM的操作与后期数据分析简单、易懂,在多个医学研究领域收到了广泛关注并发展起来,高分辨率熔解曲线已经成为医学上DNA诊断的最为理想的解决方法。 Thank you! 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同 每一个合同