TG电转感受态制备与主要影响因素.pptVIP

White Clover 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 2014-12-23 相关概念 实验原理 方法特点 实验步骤 影响因素 感受态细胞 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的一种细胞状态。 转化 是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 一、相关概念 二、实验原理 化学方法 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃的CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃、90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。DNA分子通过复制、表达、实现遗传信息的转移，使细胞获得新的遗传性状。常制备的感受态菌株：DH5α、TOP10、DE3、JM109等。 电转化法 电转化法利用瞬 间高压电脉 冲，使 细胞表面产生暂时性 的孔 隙，可在细胞 膜表 面形成小孔 ，同时 由于电击作用可促 使细胞膜 融 合 ，最后 在细胞膜上 形成大 的孔 道，易于 DNA 进入 。常制备的感受态菌株：TG1。 化学感受态细胞制备 取－70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。 第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37 ℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。 当菌落600nm OD值达到0.3－0.4时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,4000g离心10分钟。弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。 加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。4℃,4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液. 加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体。每管0.2ml分装，至4℃保存备用，24－48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于－70℃的低温冰箱中。 TG1电转感受态细胞的制备 用10ul无菌枪头挑取TG1单克隆划线接种于2YTG板(2YT培养基中加2％的葡萄糖)，37℃过夜培养。 挑取TG1单克隆到25ml 2YT培养基中，250rpm、37℃过夜培养。 早上将摇过夜的菌液分别取5ml接种于2个500ml的2YT培养基中，250rpm、37℃摇到OD600≈0.6。 下面的操作全部在冰上进行： 将摇好的菌液在超净台中分装到2个无菌的500ml 离心杯中，4℃、3000rpm离心10min。 在超净台中小心倒去上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预冷10％甘油到总体积500ml。4℃、3000rpm离心10min。 倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，将菌液转到一个离心瓶中。加预冷10％甘油到总体积500ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离心10min。 倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预冷10％甘油到总体积250ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离心10min。 倒去甘油上清液，2.5ml的预冷10％甘油重悬菌体，用无菌枪头吸取100ul/管转入1.5ml微量离心管中（离心管作好标记且在-80℃冻存至少半小时）。马上用于电转或将离心管马上放入液氮中，冻存至少1小时，再放入-80℃冻存。 各方法特点 一般的构建重组菌株，化学法都可应对但在构建大容量基因文库和抗体库时，必须提高转化效率，采用 电转化 方法是最佳的途径。 E. Coli的生长曲线 从 0～4 h，测定 E. coli的细菌浓度(A600nm )，绘制对 数 期 生 长 曲线 (A600nm≤ 1)，如 图所 示 。 E. coli TG1和 E. coli DH5a的 生 长 曲 线 均 在 100min后开始成对数生长趋势 ，在100～15O min之间， E. coli TG1菌株的生长速度 比 E. coli DH5a菌 株快。 E.coli DH5a在不同时间的转化效率