鸡小肠隐窝的分离培养及其特性的研究-基础兽医学专业论文.docx

浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑豳I拦或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： w肜年；月刁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝江太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 剔醛轹励所 签字日期： Ⅻ“年 ；月27日 签字日期： zc．膨年；月芎7日 万方数据 目录摘要 目录 摘要 ． i Abstract ．iii 缩略词表 “i 第一章文献综述 ．1 第一节小肠的的功能与更新 ．1 1．1小肠的结构和功能 1 1．2小肠更新的研究进展 一2 第二节小肠隐窝的研究进展 ．3 2．1小肠隐窝的结构 3 2．2小肠隐窝中细胞的种类分布 ．4 2．3小肠隐窝的生理功能 ．5 2．4小肠隐窝的分离技术 ．6 2．5小肠隐窝的体外培养技术 7 2．6培养隐窝的特性探索 7 2．7小肠隐窝的研究展望 ．8 第三节本研究的目的和内容 ．9 3．1本研究的目的和意义 9 3。2本研究的内容 9 第二章鸡小肠隐窝的分离与培养 10 第一节引言 10 第二节材料与方法 ．1 1 2．1实验动物 ．11 2．2主要器材 ．．11 2_3主要试剂及配制 一12 2．4小肠样本采集及处理 ～12 2．5小肠隐窝的分离方法建立 一13 2。6小肠隐窝体外培养方法的建立 一14 第三节结果 15 3．1分离以及纯化后的隐窝 ．．15 3．2不同培养基条件下培养隐窝的生长情况 一16 3．3隐窝生长的形态观察以及数据统计 ．．17 第四节讨论 18 第三章培养隐窝的特性探索 20 第一节引言 20 第二节材料与方法 21 万方数据 2．1实验材料 2．1实验材料 ．．2l 2．2主要器材 ．．2l 2’3主要试剂及配制 22 2．4透射电镜观察隐窝结构 ． ．23 2．5石蜡切片制作与小肠隐窝形态学观察 ．．23 2．6 RNA提取 24 2．7 cDNA合成 25 2．8 PCR 25 2．9琼脂糖凝胶电泳 一26 2．10 RT．PCR ．26 2．11培养隐窝中性红染色 27 2．12培养隐窝中细胞增殖的检测 28 2．13培养隐窝立体结构展示 29 2．14 CHIR99021对隐窝生长的影响 29 第三节结果 30 3．1隐窝的形态 ．．30 3．2隐窝的干细胞表达情况 一30 3．3隐窝DAPI染色 32 3．4隐窝中性红染色． ．33 3．5隐窝Edu染色 34 3．6隐窝对CHIR99021的反应 34 3，7 CHIR99021对隐窝干细胞标记基因表达的影响 ．．35 第四节讨论 36 第四章结论和创新点 38 致谢 40 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 小肠是动物消化和吸收的重要器官，小肠黏膜是其发挥作用的关键部位。小 肠上皮细胞向下移动凹陷后形成隐窝结构，大约6～10个隐窝支持一条小肠绒毛 的生长与代谢。隐窝是小肠上皮细胞的生长源头，在隐窝的内部存在小肠干细胞 和潘氏细胞。隐窝在小肠的更新中起着十分重要的作用。本实验采用低温酶消化 并结合离子螫合剂的方法分离和纯化两周龄鸡小肠的隐窝，并将分离到的隐窝进 行培养，然后检测隐窝的进行形态变化、标记基因表达和细胞增殖活性，旨在建 立鸡小肠隐窝的分离和培养方法，为家禽小肠更新和功能的研究提供实验技术平 台。 1，小肠隐窝的分离和培养 小肠隐窝是小肠上皮细胞下陷而形成的特殊壁龛样的结构，在隐窝中存在特 殊的小肠上皮细胞如潘氏细胞和小肠干细胞。本实验以两周龄的海兰鸡小肠作为 材料，通过低温物理方法，在离子螯合剂中孵育小肠片段以分离隐窝。刚分离得 到的大量绒毛碎片以及单个细胞在孵育振荡后显微镜下检查，可观察到绒毛．隐 窝单位，更换新的分离液后继续孵育隐窝，可得到大量小肠隐窝。用200目筛网 过滤以及梯度离心的方法纯化隐窝，显微镜下检查计数，每只雏鸡可获得15000 个左右结构完整的隐窝。将分离的隐窝按200个左右150 lal液体的密度接种到 Matrigel立体培养基中，同时加入三组不同浓度的添加物，包括表皮生长因子 (EG