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... ... 选修 3《现代生物科技专题》 专题 1 基因工程 基因工程的 概念 基因工程是指按照人们的愿望 （定向变异） ，进行严格的设计，通过 体外 （体内、体 外）DNA重组和转基因技术， 赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物 类型 和生物 产品 。基因工程是在 分子 水平 上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重组 技术 。 基因工程技术的 原理： 基因重组 基因工程的 优点： （1）目的性强，能够定向的改变生物的品质。 （2）克服远缘杂交不亲和。 基因工程的基本工具 “ 分子手术刀 ”—— 限制酶 （全称：限制性核酸内切酶） （1）主要来源： 原核生物 。 （2）功能：能够识别双链 DNA分子的某种 特定 的核苷酸序列（被识别序列具 反向对称 特 点），并且使每一条链中 特定 部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 断 开，因此具有 专一 性。 （3）结果：经限制酶切割产生的 DNA片段末端通常有两种形式： 黏性 末端和 平 末端。 （4）与解旋酶的区别： 解旋酶：断开碱基对间 氢键 限制酶：断开两个脱氧核苷酸之间（即磷酸与脱氧核糖之间）的 磷酸二酯键 “ 分子缝合针 ”——DNA连接酶 (1) 两种 DNA连接酶（ E· coli DNA 连接酶和 T4 DNA连接酶）的比较： ①相同点：都连接 磷酸二酯 键。 ②区别：E· coliDNA 连接酶来源于 T4 噬菌体 ，只能将双链 DNA片段互补的 黏性末端 之间的磷 酸二酯键连接起来；而 T4DNA连接酶能缝合 两种末端 ，但连接平末端的之间的效率 较低。 (2) 与 DNA聚合酶作用的异同 : DNA 聚合酶：只能将 单个核苷酸 加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA 连接酶：连接 两个 DNA片段 的末端，形成磷酸二酯键。 “ 分子运输车 ”——运 载体 （1）运载体具备的条件：① 具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA片段插入 。 ②能在受体细胞中复制并稳定保存 。 ③具有标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择 。 ④能在受体细胞中稳定保存（ 对受体细胞无害 ）， 大小合适。 （2）最常用的载体是 质粒 , 它是一种裸露的、结构简单的、 独立于细菌染色体之外， 并具 有自我复制能力的 很小的 双链 环状 DNA 分子。 （3）其它载体： λ噬菌体的衍生物 、 动植物病毒 。 （4）在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工 改造的。 基因工程的基本操作程序 1 步骤：1、 获取目的基因 ， 2 、 基因表达载体的构建 ， 3 、 将目的基因导入受体细胞 ， 4 、 目的基因的检测和鉴定 。 第一步：获取目的基因 目的基因范围：编码蛋白质的基因、具有调控作用的因子。 目的基因 来源 ：自然界获得或人工合成 自然界获得： 采取 直接分离 法--- 用适当的限制酶处理得到。 工作量大，多为原核基因来源。 人工合成： 反转录法 和 化学合成法 。操作复杂，基因结构不完整，多为真核基因的来 源。 补： 基因结构 原核基因、真核基因均有两种区域： 编码区 、 非编码 。但真核基因的前者是 不连续的，分为 外显子 和 内含子 。 目的基因的（大量）获取方法 （1）从基因文库获取 A.基因文库分类：基因组文库、 部分基因文库 B.获取方法：据 目的基因 的有关信息，以及基因的表达产物蛋白质等特性。 C.两种文库中目的基因的来源： 基因组文库的目的基因来源于 自然界直接分离法获得 。 cDNA 文库的目的基因来源于 反转录法人工合成 。 D.两种文库中目的基因的区别：书 P10表格 （2）PCR( 多聚酶链式反应 的缩写) 技术.( 发明人：穆里斯等人 ) A.原理： DNA 双链复制 B.特点： 体外 复制， 指数 增加， 需要 （需要、不需要）模板。 C.过程： 第一步：高温解链（变性）：加热至 90～95℃， 双链 DNA受热解成单链 （不需解旋酶）； 第二步：低温引物（复性）：冷却到 55～60℃， 引物与模板单链 DNA互补结合 ； 第三步： 中温复制 （延伸） ：加热至 70～75℃，热稳定 DNA聚合酶从引物起始互补链的合成 。 第四步：重复一至三步。 D.所需条件：模板为 目的基因 ，原料为 四种脱氧核苷酸 ，酶为 热稳定 DNA聚合酶 ，能量由 ATP 直接提供。 （3）化学合成法人工合成 （通过 DNA合成仪） 特点：A. 基因较小 B. 核苷酸序列已知 C. 不需模板 第二步：基因表达载体的构建 目的：将目的基因 导入 受体细胞，并使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至 下一代（ 复制 ），使目的基因能够 表达 和发挥作用。 组成： 目的基因 ＋启动子 ＋终止子