活跃链霉菌中耐抗生素的rRNA甲基转移酶NSR的表达、纯化与结构分析-化学生物学专业论文.docxVIP

活跃链霉菌中耐抗生素的rRNA甲基转移酶NSR的表达、纯化与结构研究 活跃链霉菌中耐抗生素的rRNA甲基转移酶NSR的表达、 纯化与结构研究 摘 要 抗生素是人类抵抗病原微生物感染的重要手段，挽救过无数人的生命。然而， 随着抗生素的广泛使用，抗生素的滥用越来越严重，导致微生物的抗药性问题越来 越棘手。于是研究微生物抗药性的分子机理就变得极为重要。诺西肽是一种广泛使 用的兽用抗生素，它是利用对其不敏感的微生物活跃链霉菌来生产的。活跃链霉菌 中有一种抗性基因编码rRNA甲基转移酶NSR，它能甲基化诺西肽与核糖体50S大亚 基上的23S rRNA的结合处的A1067，从而使诺西肽无法结合而失效。然而，NSR的 晶体结构以及其酶活作用的分子机理仍然是未知的。 我们运用基因工程技术，利用大肠杆菌表达系统表达和纯化了NSR，生长出了 衍射很好的蛋白晶体，并收集了衍射数据和解析了蛋白单体的晶体结构(1．9 A)以及 SAM共晶的晶体结构(2．25 A)。 在此基础上，我们基于结构分析了系统地设计了不同的突变体来研究NSR的功 能。从晶体结构可以看出，NSR以同源二聚体的形式存在，表明NSR的二聚化对它 的甲基转移酶的功能有着重要作用。 整个NSR蛋白分为NTD和CTD两部分。NTD具有RNA结合结构域，而CTD则能 将SAM上的甲基转移到RNA底物上。因此我们对这两个功能区都进行了研究。我们 运用点突变的方法，基于对各区域的结构的分析系统的设计了一系列突变体，并在 体外测试了各突变体的活性。结果显示，有两个环对NSR的功能是必须的。 关键词：NSR、rRNA甲基转移酶、蛋白纯化与结晶、结构解析、功能研究 中图书分类号：Q51 Crystal Crystal Structure of the Nosiheptide Resistant Methlytransferase of Streptomyces actuosus Abstract Antibiotics play significant roles in the battle against pathogenic microorganism in human history and ever saved countless lives．However,as the broader application， abusing of antibiotics is becoming increasingly serious problem which followed by dangerous drug resistance．Thus the research in the molecular mechanism of microorganism drug resistance is extremely important．Nosiheptide is a kind of widely used antibiotic which is produced by a microogranism named Streptomyces actuosus，which is insensitive to the substance．Streptomyces actuosus bears a gene which codes for the resistant enzyme of rRNA methyltransfemse NSR．The protein NSR is able to neutralize nosiheptide by methylating the A 1 067 at the antibiotic binding site of 23S rRNA on the 50S subunit of ribosome．Nevertheless，the crystal structure of NSR and the detailed enzymatic mechanism remain unknown． In this work，NSR Was expressed，purified and crystallized．Finally we obtained both crystals of single NSR and complex of NSR and SAM which were suitable for data collection．ne single protein of NSR and NSR in complex with SAM structures were determined at 1．9 and 2．25，respectively． Based on the crys