活性荧光染料定量检测体内外肿瘤细胞增殖和分离细胞亚群-内科学（消化系病）专业论文.docxVIP

硕士学位论文染料，是一种亲脂性膜染料，它在水溶液中荧光极弱，然而当用稀释的染液标 硕士学位论文 染料，是一种亲脂性膜染料，它在水溶液中荧光极弱，然而当用稀释的染液标 记细胞时，DiO／DiD中的烷基链嵌入细胞膜的磷脂双份子层中，并激发出强烈的 绿色／红色荧光。用于示踪细胞增殖时，随着细胞的每一次分裂，膜染料DiO／DiD 的荧光能准确地平分到两个子代细胞上。DiO／DiD染料具有低荧光变异性、良好 的标记稳定性、低细胞毒性以及极少发生细胞间转移这些优点，此外，DiO／DiD 并不影响标记细胞及后代细胞的增殖，并能通过建立细胞分裂标准曲线定量检 测体内外细胞分裂情况。鉴于DiO／DiD染料的这些特性，本课题组探究了 DiO／DiD标记体内外培养细胞的可行性，检测了DiO／DiD标记细胞的分群情况， 并结合CDl33抗原分子的表达分析肿瘤细胞耐药性。 利用本文中建立的DiO／DiD标记肿瘤细胞定量检测细胞增殖的方法，我们 还探究了肝脂肪酶(hepatic lipase)及CDl33在HepG2肝癌细胞化疗耐药中的 作用。在本课题组的前期研究中，针对肝脂肪酶(LIPC)基因构建EGFP．shRNA 干扰慢病毒载体，转染HepG2细胞并筛选稳定表达株，发现下调LIPC后HepG2 细胞增殖显著减慢，克隆形成显著减少，且CDl33阳性细胞百分比亦显著下降， 对阿霉素、5．fu化疗产生抵抗。本研究利用DiO／DiD标记细胞的方法进一步探 讨LIPC、CDl33与肿瘤细胞增殖和化疗的关系。 研究方法 1．细胞膜荧光染料DiO／DiD的研究，包括其细胞毒性及标记稳定性。 1．1 MTT法检测细胞膜荧光染料染色后细胞的增殖。分别检测Lovo细胞、SW480 细胞、SW620细胞、CT26细胞以及HepG2细胞的增殖情况。 1．2流式细胞术检测Di0／DiD标记的稳定性。 1．2．1体外培养：将DiO标记的人HepG2细胞与未标记的小鼠CT26细胞以l：l 的比例共培养l周，然后用Percp．EPCAM抗人抗体染色后，上流式细胞仪检测。 该方法原理：EPCAM抗体为抗人抗体，因此HepG2细胞高表达EPCAM，而 CT26为小鼠细胞，不表达EPCAM，因此利用EPCAM和DiO／DiD双染色可以 检测细胞膜染料在细胞之间是否发生转移。 III 万方数据 中文摘要1．2．2体内培养：收集DiD标记的HepG2单细胞悬液并注射到BALB／c小鼠肝 中文摘要 1．2．2体内培养：收集DiD标记的HepG2单细胞悬液并注射到BALB／c小鼠肝 被膜下，并以未标记DiD的HepG2细胞作为阴性对照，8天后分离肝内肿瘤并 制得单细胞悬液，染Percp．EPCAM抗人抗体后流式检测。 2．建立定量检测体内外肿瘤细胞增殖的标准曲线。 2．1方法原理：研究表明DiO染料的荧光强度在一定时间内(515天)并没有发 生衰减，DiO标记细胞后随着细胞的每一次分裂，荧光平均分配到两个子代细胞 中，因此我们可以推断出：当M为细胞平均荧光强度，N为细胞数目，S为细 胞分裂次数，可有以下公式成立：M初木N初=M末木N末，l092M初／M末=S=l092N未 ／N仞，即S=l092M初．1092M术。由于M初为一可检测固定值，因此可应用R软件 对S和M柬进行对数曲线拟合，建立细胞分裂标准曲线。 2．2不同血清浓度培养下细胞增殖分裂标准曲线。将DiO标记的细胞后以合适密 度铺于六孔板中，用含不同血清浓度(10％、5％、2．5％、1．25％、0．625％)的培 养基培养至80％～90％汇合度后，收集细胞并进行细胞计数，流式检测每：fk-幺E]胞 的平均荧光强度。应用R软件、Excel建立细胞平均荧光强度值与细胞分裂次数 之间的对数拟合公式和拟合曲线。根据标准分裂曲线公式，可通过检测DiO标 记后的荧光强度计算活细胞亚群的分裂次数。 2．3不同培养时间细胞增殖分裂标准曲线。DiO标记的CT26细胞和HepG2细胞 以适当密度N1培养于六孔板中，当细胞汇合度达80％～90％时，收集细胞，取 l／5细胞继续培养，剩余4／5细胞进行细胞计数记为N，并测定其平均荧光强度值 M末。重复以上步骤直到细胞平均荧光强度衰减至与DiO自发荧光接近。假设细 胞标记培养后不进行收集检测，则每个时间点收集的细胞总数目Nn可由以下公 式计算得到：N。=(5N／4)x5”1(n为细胞的收集次数)。细胞分裂次数S=l092M 初／M末=l092N。／N1，应用R软件、Excel建立细胞平均荧光强度值与细胞分裂次数 之间的对数拟合公式和拟合曲线。 3．DiO标记方法的体内外应用研究。 3．1 DiO标记肿瘤细胞在化疗后的作用。DiO标记的HepG2细胞分别用不同浓度 IV 万