急性运动轴索型吉兰—巴雷综合征患者血清对体外培养脊髓运动神经元的影响-神经病学专业论文.docx

中文摘要化标记物的表达，电镜．F可发现有巨噬细胞包绕等。为了进一步研究 中文摘要 化标记物的表达，电镜．F可发现有巨噬细胞包绕等。为了进一步研究 AMAN的痫[-N不rl发病机制，实验rII建菠』f：优化r体外胚胎火鼠脊髓前 角运动神经元的原代培养体系。这种体外脊髓神经元j-卉养·II，缺乏在 体实验研究中难以避免的淋巴细胞、单核巨噬细胞以及补体成分等， 这对研究免疫系统中免疫机制参与运动神经元轴索的损害提供了便利 条件；除此之外，实验中培养的胚胎大鼠脊髓前角运动神经元发出的 轴突样突起的外面没有髓鞘包绕，可直接观察到致病因素对轴索损害 的动态变化，为阐明AMAN的致病机制提供一定的理论基础。 神经元作为-le0高度分化的细胞，形态上有胞体胞突之分。在单 细胞培养中，相对于机体的其他细胞，在体外难以存活和生长，尤其 是脊髓神经元，作为下运动神经元，对营养要求极高，对环境变化也 极其敏感。因此，在实验的前两部分中，首先进行体外脊髓运动神经 元的分离与鉴定，建立体外原代培养体系。为了优化培养方法，我们 观察了不同包被基质和神经营养因子等对培养脊髓运动神经元生长状 况的影响，寻找较适合神经元存活并利于以后实验研究的条件。第三 部分是观察AMAN病人血清对培养脊髓运动神经元的作用。下面筒述 这三部分。 一、不同生长底物对体外培养脊髓运动神经元生长的影响 目的：首先建立脊髓运动神经元的体外培养，并对分离的细胞进 行鉴定，以确定为脊髓运动神经元；在此基础上，观察了不同溶剂溶 解稀释的多聚赖氨酸(poly．1．1ysine，PLL)对脊髓神经元体外生长的影 响，确定一种较好的方法以便进行以后的实验；随后，选取多种包被 底物如PLL、I型胶原、层粘连蛋I兰t(1aminin，LN)以及PLL和LN联合 等进行包被，观察不同底物对胚胎大鼠脊髓运动神经元在体外存活生 长的影响。 方法：在SD大鼠怀孕15天时，无菌条件下取出胚胎，解剖显微 镜下取脊髓，取其腹侧组织切成小块，消化后制成单细胞悬液，差速 贴壁以去除成纤维细胞，置于C02培养箱中培养。培养细胞经神经元 特异性烯醇化酶(NSE)抗体和抗神经丝单克隆抗体一SMI．32的免疫 组织化学染色，对培养细胞进行鉴定。多聚赖氨酸分别用蒸馏水、磷 酸盐缓冲液(PBS)、两种浓度的硼酸溶液溶解后对培养板进行包被， 2 中文摘要接种制符的细胞悬液进行培养观察。不同的包被底物选取PLL、I型 中文摘要 接种制符的细胞悬液进行培养观察。不同的包被底物选取PLL、I型 胶原、LN、PLL联合LN等J蛹fl进行包被，对照组以蒸馏水代替。观 察儿种力‘法一II培养神经元的存活数目、神经元突起的平均长度以及神 经元的生长分布等状况。 结果：本实验建立的细胞培养体系为脊髓运动神经元的原代分散 细胞培养，NSE抗体染色显示神经元的纯度达90％以上，SMI．32抗体 染色能很好的显示脊髓运动神经元的形态：胞体大，为多极性，具有 单个长的轴索样突起；以大的SMI．32阳性细胞进行计数，表明脊髓运 动神经元占培养细胞总数的70％以上；神经元体外培养必须要求包被 底物，否则将难以存活，对照组中细胞在24～36小时后死亡；当培养 板包被底物后，神经元贴壁良好，部分细胞在短时间内长出突起，初 步具有神经元形态，一周内达到生长旺盛期，各时间段包被组在细胞 存活数、突起的平均长度等方面与对照组相比差异显著；PLL各组之 间的细胞生长情况相比，在24小时观察，双蒸水配制组和PBS配制 PLL组之间在神经元存活数目、已经生长突起的神经元数目和细胞突 起的平均长度等方面均无差异；在0．IM和0．01M硼酸配制PLL组， 细胞存活数以及生长突起的细胞数和突起长度均相对较高(与PBS配 制PLL组相比，P0．05)，其中0．01M硼酸组更好一些，而且具有统 计学差异。在培养6天时观察，前三组神经元生长良好，但有不同程 度的神经元聚集现象，而0．01M硼酸组的神经元虽然突起长度无明显 变化，但神经元基本分散均匀，相比更有利于形态学观察；应用各种 包被底物进行比较，发现单独应用LN包被时，虽然有少部分细胞发生 贴壁，但只能短时间存活，在培养的24～48小时后逐渐死亡。I型胶 原组的细胞在接种24小时就有部分神经元聚集发生，在培养6天时， 神经元聚集更加明显，形成岛状，密集成片的中心区有均质性物质， 周边散在极少数的单个细胞，胶原组神经元发出突起时间最晚，要迟 到培养24～36小时开始，但发出后则生长非常迅速，直径更粗大，长 度明显增长(与其余各组相比均有显著性差异)。PLL组和PLL+LN 组神经元在培养24小时有超过一半的细胞已经开始生长突起，在培养 6天时，两组细胞分散良好，细胞存活数均较胶原组高，因为聚集在一 起的细胞团计数时计为一个细胞。PLL