CO-IP步骤.docxVIP

Co-IP 步骤 将培养皿中的培养基吸干，用刮铲将细胞沿顺时针方向挂掉，用冰PBS冲洗刮铲和细胞，然后将培养皿中的细胞悬液吸入15ml离心管中1000g，4℃离心3mins，吸掉上清，再加入3ml冰PBS重悬细胞，再次离心，重复3次。 最后一次PBS冲洗离心后的细胞，倒掉上清，加入500ul细胞裂解液，然后重悬细胞，在冰上裂解15mins，然后14000rpm，4℃离心10mins，取上清液。 向相应的珠子中加入200ul IP洗珠子液（不加蛋白酶抑制剂1x的细胞裂解液）8000g，4℃离心1mins，倒掉上清，再重复操作2次，倒掉上清。 将2中的上清液一部分留存做WB,剩余做CO-IP，将这部分加入到3中珠子后，在4℃冰箱摇2h，充分混匀。 把混匀后的珠子从冰箱取出，8000g，4℃离心1mins，倒掉上清，然后用200ul IP洗珠子液重悬，再次离心，重复操作3次，倒掉上清，留沉淀。 向沉淀下来的珠子中加入60-80ul 1xloading buffer煮样5mins，8000g离心1min，将上清转移到新的EP管中，-80℃冻存或直接进行SDS电泳 孵相应一抗，二抗，显影。 Ps：小皿用珠子15ul 大皿20ul