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临床组织样本 western blotting 张晓红 2018-06-20 临床组织样本处理 对蛋白质进行定量 Western Blotting 临床组织样本处理 1. 临床组织样本包括心肝脾肺肾以及脑组织等，由于血液中成分比较复杂，为 避免其对结果的影响，在收集样本时需要将组织中的血液尽量排尽； 2. 将组织至于研钵中，用剪刀将组织尽量剪碎，再放入适量的液氮，并迅速用 钵杵研磨组织，用RIPA裂解液裂解组织。对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加 1ml RIPA裂解液，肺100~200mg加1ml RIPA裂解液。可用移液器反复吹打，或者 将组织和裂解液的混合液放在振荡器上振荡以组织得到充分裂解。过程中须尽量 保持低温，快速操作。 3. 裂解后，将裂解液移1.5ml 离心管中，于4℃离心机中，12000rpm 离心20min ， 取上清分装于0.5ml 离心管中并臵于-20 ℃保存（-80℃长期保存）。 RIPA 裂解液：可购买，也可自己配制 配方： 试剂 浓度 Tris碱 50mmol/L, PH7.5 氯化钠 150mmol/L SDS 0.1% EDTA 1mmol/L NP-40 1% 去氧胆酸钠(deoxycholate) 1% RIPA裂解液（强） RIPA裂解液（中） RIPA裂解液（弱） 1% Triton X-100, 1% NP-40, 1% NP-40, 1% deoxycholate, 0.5% deoxycholate 0.25% deoxycholate 0.1% SDS 使用时还需要加入蛋白酶抑制剂等防止蛋白质降解 对蛋白质进行定量 BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)—碧云天,货号 为P0009 产品编号 产品名称 包装 P0009-1 BCA试剂A 500ml ×2 P0009-2 BCA试剂B 30ml P0009-3 蛋白标准(BSA) 30mg ×2 P0009-4 蛋白标准配制液 5ml 1. 蛋白标准品的准备 a. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA) 中，充分溶解后配制 成25mg/ml 的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。 b. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml 。例如取20µl 25mg/ml蛋白 标准，加入980µl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中， 标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl 或PBS稀释 标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20 ℃长期保存。 2. BCA工作液的配制 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1) 配制